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CYP3A4沉默细胞株建立及其对三氯乙烯毒性的影响
目的 构建CYP3 A4基因沉默载体,转染L02肝细胞,建立CYP3A4沉默细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响.方法 根据GenBank提供的CYP3A4基因mRNA序列设计合成shRNA,将shRNA连接到pLKO.1-puro中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞.用嘌呤霉素进行筛选得到CYP3A4沉默细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定.用不同剂量三氯乙烯对正常L02肝细胞和CYP3A4沉默细胞进行染毒12h,观察凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)表达变化.结果 测序证明插入pLKO.1-puro载体的干扰序列与设计的序列一致,荧光定量PCR检测CYP3A4沉默细胞CYP3A4基因表达比正常L02肝细胞下降77.3％,Western blot实验显示CYP3A4沉默细胞CYP3A4蛋白表达水平比正常L02肝细胞下降84.6％.CYP3A4沉默细胞经三氯乙烯染毒后Bcl-2表达水平显著高于L02细胞的表达水平；Caspase-3表达水平无明显改变；Caspase-8仅在TCE高剂量组表达下降；Caspase-9在TCE剂量≥1.0 mmol/L表达水平下降；癌基因c-fos、c-myc、k-ras和p53表达水平都有一定程度下降,部分剂量组存在显著差异(P＜0.05或P＜0.01).结论 三氯乙烯对正常肝细胞和CYP3A4沉默细胞凋亡基因和癌基因表达存在明显差异,提示CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在一定关系.
关键词： 肝细胞 CYP3A4 慢病毒载体 CYP3A4基因沉默细胞 三氯乙烯 -
2,2',4,4'-四溴联苯醚(BDE-47)诱导孕烷X受体(PXR)活化能力的探讨
目的 探讨2,2',4,4'-四溴联苯醚(BDE-47)是否为孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)的诱导剂及其诱导PXR受体下游基因细胞色素P450 3A4(CYP3A4)的转录表达能力.方法 采用CCK-8法测定分析BDE-47对人肝肿瘤细胞株HepG2的细胞毒性作用,并以BDE-47分别处理双萤光素酶hPXR报告基因系统和稳定高表达hPXR的HepG2细胞株,观察其对CYP3A4的诱导作用和对其mRNA及蛋白表达的诱导作用.结果 BDE-47对HepG2细胞有明显的细胞毒性作用,且在6～48 h呈明显剂量-时间-效应关系(P<0.01).48 h为毒作用兴奋点,其半数抑制浓度(IC_(50))为110μmol/L.BDE-47能诱导CYP3A4表达量的增高,呈明显剂量-时间-效应关系(P<0.01).Q-PCR和Western Blot分析发现,其对CYP3A4的mRNA转录和蛋白表达有显著诱导作用,并呈剂量-效应关系(P<0.01),对PXR受体诱导能力明显高于已知的阳性诱导物利福平.结论 在本试验条件下,BDE-47是PXR受体的强力诱导剂,可能通过激活PXR受体而发挥其一系列毒性作用.
关键词： 2 2' 4 4'-四溴联苯醚(BDE-47) PXR受体 CYP3A4 hPXR双萤光素酶报告基因 -
三氯乙烯对3种细胞色素P450酶基因表达的影响
目的探讨三氯乙烯( Trichloroethylene, TCE )对人体淋巴细胞瘤细胞株(MCL-5)中3种细胞色素P450酶基因(CYP1A1、CYP2E1、CYP3A4)表达的影响,并研究剂量反应关系和时间反应关系.方法用常规的细胞培养方法,0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L TCE处理细胞12、24、48、72 h.利用提纯RNA和合成cDNA的药盒,合成cDNA,然后逆转录聚合酶反应(RT-PCR)表达3种CYP450基因,以β-Actin作为内对照,分析不同处理剂量和时间时基因表达的强度.结果在MCL-5细胞株中都有基本的表达,CYP1A1表达在用1.0、1.5、2.0 mmol/LTCE处理48 h后有被上调的趋势,而且上调趋势随处理时间延长而加强;CYP2E1、CYP3A4表达不受TCE处理时间长短的影响.3种CYP450酶基因的表达受TCE剂量的影响,3随0.5 mmol/L,1.0、1.5、2.0 mmol/L剂量的增加有上调的趋势.结论 TCE对CYP450酶系统中的CYP2E1、CYP1A1、CYP3A4基因有明显的诱导作用,这些基因被诱导后的结果,可能会导致相对应酶活性的增加,同时加强对TCE的代谢,使TCE的代谢产物增加.
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3种中药成分对大鼠CYP3A4酶代谢的影响
目的:探讨3种中药成分(延胡索乙素、甲基莲心碱、三七总皂苷)对CYP3A4酶代谢活性的影响,以了解中药与CYP3A4酶底物联合用药时可能产生的相互作用.方法:采用超高速离心法制备大鼠肝脏微粒体,建立体外肝脏微粒体混合酶代谢体系.以睾丸酮作为底物探针,用HPLC建立检测CYP3A4酶代谢活性的方法,分别考察体外代谢体系的适宜底物浓度、代谢时间、pH、孵育温度以及磷酸盐浓度.在确定的条件下,将3种中药成分稀释成不同浓度,分别与睾丸酮共同孵育于肝微粒体代谢体系中,测定在有或无中药成分存在下代谢产物6β-羟基睾丸酮的产生量,以评估中药成分对CYP3A4酶代谢的影响.结果:在肝微粒体孵育体系中,睾丸酮代谢为6β-羟基睾丸酮适宜的体外代谢条件为底物浓度200μmol·L~(-1),代谢时间3.5 h,pH 7.0,孵育温度37℃,磷酸盐终浓度0.1 mol·L~(-1).延胡索乙素和三七总皂苷均对CYP3A4酶的抑制作用较弱,IC_(50)>100μmol·L~(-1),甲基莲心碱有一定的抑制作用,IC_(50)为(47.5±2.3)μmol·L~(-1).结论:延胡索乙素和三七总皂苷对CYP3A4酶代谢无明显影响,提示这2种中药成分与CYP3A4酶底物之间的相互作用较低,甲基莲心碱有可能会产生微弱的药物相互作用.
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7种中药提取物对PXR介导的CYP3A4转录调节作用
目的:观察7种中药的粗提取物能否通过活化人孕烷X受体(PXR)诱导CYP3A4的转录表达.方法:采用浸提法和回流法制备中药的粗提取物.用PXR依赖的瞬时转染报告基因试验检测7种中药粗提取物的诱导作用.结果:菊花、枸杞子、丹参水提取物,菊花、山楂、金银花、山药、丹参醇提取物等均能通过活化PXR诱导HepG2细胞CYP3A4基因的转录表达.结论:菊花水提取物、枸杞子水提取物、丹参水提取物、菊花醇提取物、山楂醇提取物、枸杞子醇提取物、金银花醇提取物、山药醇提取物和丹参醇提取物等7种中药的提取物均能诱导CYP3A4基因的转录表达,其作用机制是通过活化PXR.菊花、山楂、枸杞子、金银花、山药和丹参的摄入可能影响其他CYP3A4底物在体内的代谢.
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注射用益气复脉(冻干)对大鼠肝微粒体CYP1A2,CYP3A4活性的影响研究
目的:研究注射用益气复脉(冻干)对大鼠肝微粒体细胞色素P450(CYP1A2,CYP3A4)酶活性的影响效应.方法:实验设空白对照组(生理盐水)、诱导组(苯巴比妥)和益气复脉低、中、高剂量组,连续给药7 d.采用高效液相色谱法检测,以探针药非那西丁和咪达唑仑经大鼠肝微粒体孵育后转化的代谢产物对乙酰氨基酚和1'-羟基咪达唑仑的生成速率来判定CYP1A2,CYP3A4酶的活性.结果:空白对照组、诱导组和益气复脉低、中、高剂量组的对乙酰氨基酚的生成速率分别为(1.304 ±0.205),(8.555±1.193),(2.927±0.576),(3.675±0.444),(3.024±0.552)ng·mg-1·min-1,1-羟基咪达唑仑的生成速率分别为(9.100±2.235),(47.413±4.320),(38.649 ±5.043),(36.282±3.254),(33.764±5.128)ng·mg-1·min-1.结论:注射用益气复脉对大鼠CYP1A2,CYP3A4酶的活性具有诱导作用.
关键词： 注射用益气复脉(冻干) CYP1A2 CYP3A4 高效液相色谱法 -
何首乌6种成分对人孕烷X受体介导的CYP3A4的调控作用
该文探讨何首乌中6种化学成分(没食子酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素)对人孕烷X受体(human-pregnant X receptor,PXR)介导的CYP3 A4的转录调控作用.利用前期建立的PXR介导的CYP3A4药物诱导快速筛选技术,采用MTS细胞检测方法考察化学成分对细胞活性的影响,计算IC50;利用双荧光素酶报告基因系统,将PXR表达载体和含CYP3A4转录调控区的报告基因载体共转染HepG2细胞,10 μmol·L-1利福平为阳性对照,10 μmol·L-1酮康唑为阴性对照,用何首乌中6种成分——没食子酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素(5,10,20 μmol·L-1)分别处理24h,进行双荧光素酶活性检测.结果表明,空载质粒pcDNA3.1与pGL4.17-CYP3A4共转染时没食子酸、白藜芦醇对CYP3A4的调控为抑制效应,槲皮素、山柰酚、木犀草素对CYP3 A4产生诱导作用;pcDNA3.14-PXR与pGL4.17-CYP3A4共转染时,槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素均产生诱导效应.综上所述,6种成分对CYP3A4产生抑制或激活效应,PXR参与后,5种成分对CYP3A4产生诱导效应,其中3种成分的诱导效应具有显著性差异.该研究提示,在与何首乌联合用药时应注意潜在的药物相互作用,提高安全性和有效性.
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P-gp和CYP3A4在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义
目的:研究P-糖蛋白(P-gp)和细胞色素P450 3A4( CYP3A4)在弥漫性大B细胞淋巴瘤( DLBCL)中的表达情况,并探讨二者在DLBCL多药耐药中的作用.方法:收集60例DLBCL石蜡标本,采用免疫组织化学方法检测其P-gp、CYP3A4的表达情况,并分析二者的相关性及其与DLBCL国际预后指数(IPI)、化疗反应、预后之间的关系.结果:在DLBCL中,P-gp的阳性表达率为33.3％,CYP3A4的阳性表达率为58.3％,两者的表达呈显著正相关(P＜0.05).在P-gp、CYP3A4共表达阳性组,化疗客观有效率显著低于共表达阴性组,而难治率显著高于共表达阴性组(P＜0.05).P-gp-组、CYP3A4 -组总生存时间分别较p-gp+组、CYP3A4+组人群长,两组之间差异有统计学意义(P＜0.05).结论:①P-gP和CYP3A4在DLBCL组织中均有较高程度的表达,或可作为DLBCL判断预后的指标.②P-gP和CYP3A4是判断DLBCL化疗敏感性的重要指标,并且在DLBCL的多药耐药中可能存在协同作用.二者联合检测对指导临床选择有效药物,制定个体化化疗方案具有重要意义.
关键词： 多药耐药 弥漫性大B细胞淋巴瘤 P-gp CYP3A4 预后 -
人CYP3A4第9外显子基因突变频率的检测
目的建立一种简便、准确、实用的人CYP3A4第9外显子基因突变频率的检测方法,并了解汉族人CYP3A4第9外显子的分布特点.方法应用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增人CYP3A4第9外显子基因序列,扩增产物用限制性内切酶HinfⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切位点的限制性片段长度多态性(RFLP)图谱.结果运用PCR-RFLP法检测了92名汉族人CYP3A4第9外显子基因点突变,其中野生型纯合子频率为85.9%,杂合子频率为14.1%,突变型纯合子频率为0.突变等位基因频率为0.0706.结论该方法简便、快速、准确,适合于一般实验室检测及大规模的人群调查,汉族人CYP3A4第9外显子也存在相同的突变位点.
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CYP3A4和CYP2B6药物诱导剂体外筛选体系的建立
目的 构建CYP酶药物诱导剂的体外筛选技术平台.方法 利用双荧光素酶报告基因系统,将包含hPXR蛋白识别和结合调控元件的CYP3A4和2B6启动子序列插入报告基因上游,将表达载体和报告载体共转染HepG2细胞,用含有利福平或DMSO培养基培养48 h后裂解进行双荧光素酶活性检测.结果 经利福平处理的细胞裂解物荧光素酶比活性值与阴性对照组和溶剂组差异显著.结论 本研究构建的CYP3A4和2B6体外筛选平台,可以有效地用于体外诱导剂的筛选.
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齐墩果酸和熊果酸的人肝微粒体代谢研究
目的 研究齐墩果酸和熊果酸的体外代谢差异,对参与熊果酸代谢的细胞色素P450酶进行鉴定.方法 考察齐墩果酸在人肝微粒体孵育体系中的代谢稳定性;采用9种细胞色素P450(CYP)选择性抑制剂和14种人重组CYP单酶分别与熊果酸共孵育,利用高效液相法检测熊果酸及代谢产物的含量,并且测定相关动力学参数Km和Vmax.结果 齐墩果酸在人肝微粒体中不代谢,熊果酸在人肝微粒体和人重组CYP单酶中的动力学行为符合米氏动力学行为,CYP3A4和CYP2C9参与了熊果酸的代谢.结论 本研究阐述了齐墩果酸和熊果酸的体外代谢规律,尤其是熊果酸的细胞色素P450代谢酶,丰富了五环三萜类化合物的药物代谢研究.
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肝药酶基因多态性及其对镇痛麻醉药品的影响
目的:细胞色素P450是药物及其他外源性物质的主要代谢酶,其亚家族成员之一CYP3A4的基因多态性是导致药物代谢个体差异的主要原因之一.笔者就CYP3A4及其他CYP450酶亚家族基因多态性对镇痛麻醉药品的影响进行讨论,为临床个体化用药提供指导.方法:通过查阅近期国内外文献及资料进行分析.结果与结论:镇痛麻醉药品芬太尼、咪哒唑仑、可待因、氯胺酮、曲马多、羟考酮等都会因CYP3A4及其他CYP450酶亚家族基因多态性的存在而在药效和不良反应等方面显现出个体差异性.为提高疗效、避免毒副作用的发生,在临床使用镇痛麻醉药物过程中实行个体化用药十分必要.
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他莫昔芬药物基因组学研究进展
他莫昔芬(tamoxifen,TAM)作为常用的非甾体类抗雌激素药物,广泛用于雌激素受体/孕激素受体阳性的乳腺癌患者的辅助治疗.TAM主要通过肝脏的细胞色素P450酶代谢为活性产物4-羟基他莫昔芬(4-OH-TAM)和N-去甲基-4-羟基-他莫昔芬(EDF),从而发挥药理作用.4-OH-TAM和EDF与受体结合的能力比TAM高30至100倍,从而能够有效的抑制雌激素受体依赖的乳腺癌细胞的细胞周期.CYP3A4和CYP2D6作为TAM主要代谢酶参与其代谢形成活性代谢物,这两种细胞色素酶都具有等位基因多的特点.CYP3A4和CYP2D6的基因多态性会影响TAM在患者体内的活性代谢物的血药浓度,从而可能会影响其治疗效果.参与TAM体内过程的主要转运体的基因多态性也会影响TAM在患者体内的血药浓度,进而影响接受TAM治疗的乳腺癌患者的临床预后效果.本文总结了TAM体内过程相关的代谢酶及转运体等的基因多态性与TAM活性代谢物浓度/疗效/不良反应的相关性,为进一步的药物基因组学研究以及临床合理用药提供参考.
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CYP3A4*18B和CYP3A5*3基因多态性对肾移植患者他克莫司剂量及浓度的影响
研究CYP3A5*3和CYP3A4* 18B基因突变对他克莫司血药浓度／剂量×体表面积(C/D’)、不良反应和急性排斥反应的影响.采用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切片段长度多态性(RFLP)方法检测227例肾移植患者CYP3A5*3和CYP3A4* 18B基因型,比较不同基因型患者之间他克莫司的C/D’值、不良反应和急性排斥反应发生率的差异.测得CYP3A4* 18B和CYP3A5*3基因型在肾移植患者中的突变频率分别为30.8％和74.2％.消除CYP3A5*3等位基因影响后,CYP3A4* 18B各基因型间他克莫司C/D’值无显著性差异(P＞0.05)；而消除CYP3A4* 18B等位基因影响后,CYP3A5* 1/*l和*1/*3基因l型患者的他克莫司C/D’值显著低于*3/*3(P＜ 0.01).CYP3A4* 18B和CYP3A5*3基因多态性与不良反应和排斥反应间差异无统计学意义(P＞0.05).
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异鼠李素对CYP3A4的调节及药物相互作用分析
观察异鼠李素对CYP3A4的转录激活、mRNA诱导及酶活性的影响,并对其在联合用药中的药物相互作用进行评价.在HepG2细胞中,采用瞬时共转染报告基因实验检测异鼠李素对PXR介导的CYP3A4的转录激活作用；荧光定量RT-PCR方法检测其对CYP3A4 mRNA的诱导作用；底物化学发光法检测其对细胞CYP3A4酶活性的影响；细胞增殖实验检测其对化疗药物伊立替康肝癌细胞毒性的影响.结果表明,异鼠李素(1、10及25 μmol·L 1)可以剂量依赖性通过激活PXR而诱导CYP3A4的转录,同时可剂量依赖性上调CYP3A4mRNA表达,但对CYP3A4酶活性无影响,对化疗药物伊立替康肝癌细胞毒作用也无影响.提示异鼠李素对CYP3A4 mRNA的诱导可能与PXR途径有关,并且可能不会干扰与其联用的其他药物的代谢.本研究可以为异鼠李素临床合理用药提供参考.
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CYP3A4与CYP3A5基因多态性与中国汉族急性白血病易感性的相关性研究
目的 检测中国汉族急性白血病(AL)患者和健康受试者中CYP3A4* 18和CYP3A5*3基因型分布特征,探讨CYP3A4和CYP3A5基因多态性与中国汉族AL易感性的相关性.方法 病例对照研究,用聚合酶链反应(PCR)后直接测序的方法,检测中国汉族AL患者91例,健康受试者200例的CYP3A4* 18B和CYP3A5*3位点的基因型分布及等位基因频率.结果 中国汉族AL患者和健康受试者CYP3A4* 18B和CYP3A5*3基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡.与健康受试者比较,AL患者CYP3A4*18B基因型及等位基因频率差异均无统计学意义(P＞0.05),CYP3A5*3基因型及等位基因分布频率差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 CYP3A4* 18B多态性与中国汉族AL的易感性可能无关,CYP3A5*3多态性与中国汉族AL的易感性可能相关.
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细胞色素P450-3A4相关的药物相互作用
目的:综述与细胞色素P450 3A4相关的药物相互作用.方法:检索Medline和中国药学文摘.结果:发现多种由CYP3A4催化代谢的药物之间可以竞争药物代谢酶,引起药物相互作用,CYP3A4的抑制剂和诱导剂均可以抑制或诱导CYP3A4催化代谢的药物代谢,导致有益或不良的药物相互作用.结论:CYP3A4催化代谢的药物联合使用,特别是CYP3A4抑制剂与底物联合使用时,可能因为抑制了药物的代谢而导致严重的药物不良反应.
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重视口服依曲康唑治疗妇科真菌感染时药物相互作用
目的 促进临床联合用药合理性水平的提高.方法 根据依曲康唑对CYP3A4的抑制作用,影响其底物药物吸收和代谢过程,探讨联合用药的药物相互作用.结果 依曲康唑通过抑制肠道CYP3A4作用可降低口服底物药物的首过效应,提高底物药物的生物利用度、抑制肝微粒体CYP3A4,使底物药物体内代谢受阻等途径,导致底物药物血药浓度升高、半衰期延长,从而增加阿普唑仑、辛伐他汀等药物A-型药物不良反应的风险.结论 医院医药专业人员应重视联合用药中依曲康唑导致潜在的药物不良反应风险.
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氟西汀和圣约翰草提取物对环孢素体外经CYP3A4代谢的影响
目的:体外考察抗抑郁药氟西汀、去甲氟西汀和圣约翰草提取物对免疫抑制剂环孢素在细胞色素P450酶介导的代谢的影响,为临床器官移植术后合理选择抗抑郁药提供参考.方法:建立以重组人CYP3A4代谢酶的体外反应体系,将氟西汀、去甲氟西汀和圣约翰草提取物分别与环孢素共孵育,用高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)法测定孵育液中环孢素浓度.结果:系列浓度的氟西汀、去甲氟西汀和圣约翰草提取物与2 nmol·mL-1环孢素共孵育后,计算求得IC50.值分别为609,205和224 μmol·L-1,K;值分别为71.45,61.15和80.13 μmol·L-1;阳性对照药红霉素能显著抑制环孢素的体外代谢,其IC50=120 μmol·L-1,Ki值为47.32 μmol·L-1.结论:氟西汀体外对CYP3A4有轻微的抑制作用,其体内代谢物去甲氟西汀能显著抑制环孢素的代谢,可为氟西汀和环孢素是否产生临床意义的相互作用提供参考;圣约翰草提取物体外亦能显著抑制环孢素经CYP3A4的代谢.
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银杏内酯B注射液对大鼠体内CYP酶活性的影响
目的:研究银杏内酯B注射液对大鼠细胞色素P450酶(CYP)亚型CYP1A2,CYP3A4和CYP2E1活性的影响,为临床合理用药提供参考.方法:将Wistar大鼠随机分组,给药组静脉推注银杏内酯B注射液10 mg·kg-1,qd,对照组给予相同体积的注射液空白溶媒,均给予7d.d8各组静脉注射茶碱20 mg· kg-1、氨苯砜10 mg·kg-1和氯唑沙宗20 mg· kg-1混合溶液,于给药后5,10,15,30 min及1,1.5,2,4,8,12,24 h采集血浆样品.用HPLC同时测定3种探针药物的血药浓度,用DAS2.0软件计算药动学参数.结果:同对照组相比,给药组茶碱和氯唑沙宗的主要药动学参数均无显著差异,但氨苯砜的表观分布容积(V1)显著增加(P＜0.05),消除半衰期(t1/2β)有明显延长趋势.结论:银杏内酯B注射液对大鼠CYP1A2,CYP2E1活性无显著影响,对大鼠CYP3A4活性可能有抑制作用.
