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蛋白磷酸酶2A催化亚基异构体过表达细胞株的构建和鉴定
目的 克隆PP2Acα异构体(PP2Acα2)并分析该基因结构,构建PP2Acα2和PP2Acα载体并建立高表达细胞株.方法 诱导HL-60细胞表达PP2Acα2,克隆PP2Acα2和PP2Acα使用pCMV-Tag4A真核表达载体构建重组质粒.通过转染建立高表达细胞株,RT-PCR和蛋白免疫印迹实验检测其PP2Acα2、PP2Acα基因和蛋白水平,使用细胞计数法检测细胞株生长曲线和流式细胞仪检测细胞周期.蛋白免疫印迹实验检测免疫球蛋白结合蛋白1(IGBP1)在构建成功的细胞中的改变.结果 经过测序鉴定PP2Acα2和PP2Acα重组质粒构建成功,PP2Acα2为PP2Acα剪切异构体缺失第五外显子.RT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示成功构建表达PP2Acα和PP2Acα2的HEK293细胞株.转染后的细胞生长曲线和细胞周期未发生明显改变.IGBP1在转染了PP2Acα2的HEK293细胞株中表达量分别是Vetor组和PP2Acα组的2.2倍和1.5倍.结论 成功克隆了PP2Acα2基因并构建了重组质粒,成功构建了高表达PP2Acα2细胞株.为阐明PP2Acα2的作用机制及其生物学效应提供了可靠的平台.
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WI-38细胞衰老与蛋白磷酸酶2A催化亚基甲基化的关系研究
目的 构建WI-38细胞连续培养衰老模型,并探讨WI-38细胞衰老与蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)去甲基化水平的关系.方法 连续培养WI-38细胞株直至细胞衰老而停止增殖,以群体倍增次数(population doubling level,PDL)记录细胞代龄并收集年轻细胞和衰老细胞,利用刃天青还原率检测细胞增殖活性,细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老率,Western blotting检测细胞内去甲基化PP2Ac的表达水平.结果 WI-38细胞连续培养至第43代时细胞停止增殖;衰老组细胞(43PDL)增殖活性明显低于年轻组(23PDL),差异具有统计学意义(P＜0.01);衰老组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率明显高于年轻组,达93％,是年轻组的4.5倍;衰老组细胞去甲基化PP2Ac蛋白表达水平明显上升,是年轻组的3.3倍.结论 WI-38细胞复制性衰老与细胞内蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)的去甲基化表达水平相关.
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蛋白磷酸酶2A的Aα亚基突变诱导人体细胞转化
目的以往的研究证明猿猴病毒40(simian virus40)编码的小T抗原(small t antigen,ST)能与细胞内蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的A亚基直接结合并抑制全酶的活力,ST的表达能诱导多种人原代细胞转化.人体肿瘤组织中可检测到PP2A Aα亚基单一染色体突变,而且部分肿瘤细胞株Aα亚基的表达水平降低.本研究的目的在于阐明Aa亚基突变是否改变酶的功能以及在诱导细胞转化中的作用及机制.
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诱导性ppp2r1a基因敲除小鼠模型的表型和机制研究
目的 研究诱导性ppp2r1a基因全身敲除对成年小鼠的主要生理功能影响并探讨相关机制.方法 将ppp2r1aflox/flox小鼠和CAGG-CreER小鼠杂交繁殖,获得20只CAGG-CreER ppp2r1aflox/flox小鼠,设立为纯合子组,并同时选取同窝野生型小鼠20只,采用单纯随机法,将纯合子、野生型小鼠分别分为4组,共8组,每组5只,腹腔注射他莫昔芬0、2、4、6 d,建立ppp2r1a基因诱导性敲除小鼠模型.采用Western blot法检测主要脏器中PP2A Aα(由ppp2r1a基因编码)的敲除效率,并观察小鼠体重、脏器病理改变以及外周血细胞计数和血生化,采用Real-time PCR法检测肝脏糖脂代谢相关基因的表达改变.结果 他莫昔芬注射6 d后,小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑的PP2A Aα敲除效率分别约为35%、12%、15%、60%、69%和72%.他莫昔芬注射6 d后,纯合子小鼠体重[(17.42±1.76)g]低于野生型小鼠[(21.69±1.82)g](P<0.05).纯合子小鼠活动减少,腹部和肾周脂肪少,存活不超过7 d.第6天后,纯合子小鼠脾脏的脏器系数[(0.36±0.05)%]低于野生型小鼠[(0.59±0.10)%](P<0.05),组织病理HE染色显示脾脏萎缩明显,有核细胞明显减少.Tunel染色发现脾脏中淋巴细胞凋亡增多.纯合子小鼠血浆中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平[(153.68±62.80)U/L和(193.2±44.28)U/L]均高于野生型小鼠[(41.02±12.91)U/L和(69.40±9.55)U/L](P值均<0.05),提示ppp2r1a敲除导致肝损伤.纯合子血糖水平[(4.20±1.99)mmol/L]低于野生型[(8.88±0.65)mmol/L](P<0.05),而总胆固醇、HDL-C和β-羟基丁酸(β-HB)水平[(3.12±0.39)、(1.53±0.38)和(2.49±0.89)mmol/L]均高于野生型小鼠[(1.69± 0.92)、(0.78±0.50)和(0.45±0.30)mmol/L](P值均<0.05),表明ppp2r1a敲除会扰乱葡萄糖和胆固醇代谢.此外,纯合子小鼠白细胞计数(WBC)和淋巴细胞计数[(1.88±0.89)×109/L和(0.92±0.37)×109/L]低于野生型小鼠[(3.91±0.80)×109/L和(2.74±0.52)×109/L](P值均<0.05).纯合子小鼠肝脏中糖异生基因葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的mRNA相对表达水平[(0.46±0.11)和(0.72±0.07)]均低于野生型小鼠[(1.02±0.07)和(1.02±0.06)](P值均<0.05).结论 全器官ppp2r1a基因对成年小鼠的存活是必不可少的,且ppp2r1a基因可能通过调控肝脏葡萄糖和胆固醇代谢发挥重要作用.
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柴胡疏肝散对阿尔茨海默病大鼠记忆功能的相关研究
目的:探讨柴胡疏肝散在阿尔茨海默病( Alzheimer's diseas,AD)治疗中的意义.方法:大鼠随机分6组,其中模型组(C),柴胡疏肝散低剂量和高剂量组(D,E),补肾组(F)均采用D-半乳糖(ip)和β-淀粉样蛋白(Aβ)双侧海马注射联合造模,Aβ造模成功后的第9d,D,E组分别ig给予柴胡疏肝散10,20 g·kg-1,F组给予脑力宝20 g·kg-1.各组均在每天上午9:00按10 mL·kg-1的容积ig给药,连续ig 28 d.ig前后分别进行水迷宫行为学检测,后处死动物取海马进行相关指标信使RNA (mRNA)表达的相对含量测定.结果:柴胡疏肝散高剂量组ig前后迷宫寻找平台时间分别为(17.34±3.35),( 12.78±2.54)s,补肾组分别为(17.79±2.25),(14.11±2.66)s,2组ig前后比较及ig后与同期的模型组比较均有显著差异(P＜0.01).给药后,2组海马蛋白质磷酸酶-2A(PP-2A) mRNA的表达值分别为(0.230 4 ±0.035),(0.199 4±0.022 2),与模型组(0.099±0.028 8)比较明显增加(P＜0.01),而细胞周期依赖性蛋白激酶5(CDK-5)和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β) mRNA的表达高剂量组,补肾组比较及高剂量,低剂量组比较均明显降低(P＜0.01).结论:柴胡疏肝散通过抑制动物海马GSK-3β,CDK-5表达而增强PP-2A的表达,可以逆转Aβ诱导的tau蛋白过度磷酸化,从而对记忆、认知障碍起到积极的调节作用.
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CIP2A shRNA真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖的抑制作用
目的：构建靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒并探讨其对胃癌细胞增殖的调节作用。方法根据siRNA原理设计4对靶向CIP2A的siRNA序列，克隆到真核表达载体pGPU6／GFP／Neo中（shRNA-1、2、3和4）。脂质体转染人胃癌细胞系BGC-823，real-time PCR和Western blot法检测并筛选佳抑制效率的shRNA表达质粒，CCK-8法检测对胃癌细胞增殖的影响。结果4个靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒经限制性酶切和测序证实基因已正确插入，转染效率可达到70％以上。转染后24、48和72 h，4个质粒均明显降低BGC-823细胞内CIP2A mRNA 和蛋白的表达。相较于其他3个重组质粒，shRNA-1的抑制作用更为显著，且对胃癌细胞增殖有明显的抑制作用（ P＜0.05）。结论成功构建的靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒，可有效抑制胃癌细胞CIP2A的mRNA和蛋白表达，并抑制胃癌细胞的增殖，为今后研究CIP2 A在胃癌中的作用机制奠定了基础。
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冈田酸诱导大鼠海马神经元Tau 蛋白过度磷酸化
目的研究蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(OA)对海马神经元微管相关蛋白(Tau)磷酸化的影响,建立Tau过度磷酸化的大鼠模型.方法实验随机分为正常组、二甲基亚砜(DMSO)对照组、OA模型组.模型组又分为OA 12 h、24 h、48 h和2周组.OA模型组大鼠海马CA1区背侧定向注射1.5μl溶于10%DMSO的OA,DMSO对照组注射1.5 μl 10%DMSO溶液.通过Bielschowski染色、免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹分别观察海马神经元形态的改变和磷酸化Tau的表达水平;检测蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性,了解其动态变化与Tau磷酸化的关系.结果OA模型各组与正常组和DMSO对照组比较,Bielschowski染色示海马神经元胞体和突起着色较深,欠均匀,部分神经元轴丘处浓染成斑块状,但各模型组均未见到老年斑和神经元纤维缠结样改变;免疫组织化学染色示模型组海马神经元Thr231和Ser199/202磷酸化Tau蛋白表达增加,与DMSO对照组相比具有显著意义(P＜0.05);蛋白免疫印迹提示OA可引起Tau蛋白Thr231、Ser396和Ser199/202位点发生磷酸化,且不同位点磷酸化的稳定性不同,注射OA 48h后PP2A的活性明显降低,其变化与Tau蛋白Thr231和Ser396位点的磷酸化改变相一致.结论海马CA1区背侧单次注射OA可诱导建立神经元Tau蛋白过度磷酸化的大鼠模型.
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蛋白磷酸酶2A的亚基功能
蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是一种由催化亚基C、结构亚基A和多种功能特异的调节亚基B组成的全酶复合物,其在基因表达、细胞增殖分化和信号转导等方面有重要调控作用.各种不同亚基组成功能各异的PP2A全酶,调控不同的细胞功能.各亚基在PP2A功能调控中均起关键作用.本文重点介绍PP2A各个亚基在PP2A生物学功能实现中的作用.
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PPP2RC基因结构特点和生物学功能
PPP2R5C是蛋白磷酸酶2A的调节性亚单位中一个家族成员,它在调节细胞增殖、分化和转化等方面具有重要作用,其作用主要通过对P53蛋白某些位点氨基酸的去磷酸化而实现.近期研究提示,PPP2R5C基因表达模式的改变与细胞恶性转化相关;此外,有研究发现PPP2R5C可以作为B-CLL病情进展的相关标记.本文就PPP2R5C基因结构、生物学功能及PPP2R5C基因与肿瘤发生发展的关系进行了探讨.
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蛋白磷酸酶2A在三氧化二砷诱导NB4、MR2细胞株凋亡过程中的变化
本研究探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)诱导NB4、MR2细胞凋亡过程中蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性与表达的变化.不同浓度ATO单用或与冈田酸(OKA)联合作用于NB4、MR2细胞,然后采用MTT法测定药物对细胞增殖的影响,用瑞氏染色法观察细胞形态学变化,流式细胞术测定细胞凋亡率,丝/苏氨酸磷酸化酶检测试剂盒分析药物对细胞内PP2A活性的影响,Western blot检测细胞内PP2A各亚基表达.结果表明:蛋白磷酸酶抑制剂OKA能明显增强ATO对NB4、MR2细胞的增殖抑制;OKA能促进ATO诱导的NB4、MR2细胞凋亡;ATO诱导NB4、MR2细胞凋亡过程中PP2A活性均下降,且随ATO浓度的增加PP2A活性下降越明显;与OKA连用后PP2A活性下降更加明显;在ATO诱导NB4、MR2细胞凋亡过程中,PP2A/A表达较对照组均明显减少,而B和C亚基表达与对照组比较变化不明显.结论:在ATO诱导的NB4、MR2细胞凋亡过程中,细胞内PP2A/A表达减少,PP2A活性降低,且随ATO浓度增加PP2A活性下降越明显,抑制PP2A活性有助于ATO诱导的NB4、MR2细胞凋亡.
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鱼藤酮对MN9D细胞蛋白磷酸酶2A活力的影响
目的 观察鱼藤酮是否诱导蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活力下降,并探讨其机制.方法 小鼠中脑多巴胺能细胞系MN9D细胞分为正常组(正常培养)、对照组(培养液中加入与鱼藤酮组等体积的二甲基亚砜)、鱼藤酮组(培养液中加入不同浓度鱼藤酮培养24 h)和鱼藤酮+C2组(5μmol/L C2-神经酰胺预处理8 h后,50 nmol/L鱼藤酮暴露24 h).MTT法检测细胞活力,Western blotting分析总PP2A水平及酪氨酸磷酸化水平,比色法检测PP2A活性.结果 与对照组相比,鱼藤酮组细胞活力明显下降(P<0.01),PP2A催化亚基酪氨酸磷酸化提高(P<0.01),PP2A活性降低(P<0.05).鱼藤酮+C2组PP2A酪氨酸磷酸化水平较鱼藤酮组明显降低(P<0.01),PP2A活性提高(P<0.05),细胞活力明显提高(P<0.01).结论 鱼藤酮通过提高PP2A催化亚基307位点酪氨酸磷酸化水平,抑制PP2A活性,并可能参与细胞活力下降.可为发现帕金森病药物作用靶点提供参考.
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蛋白磷酸酶2A诱导肠上皮细胞凋亡机制研究进展
蛋白磷酸酶2A是细胞内重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,通过可逆性磷酸化使已磷酸化的蛋白质脱磷酸,参与细胞内众多信号通路和生理生化过程的调节.其生理活性的改变与肠上皮细胞损伤后凋亡、再生的发生密切相关,可能是肠上皮细胞凋亡与再生达到平衡的一个调节因子.
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靶向SET的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定
目的:针对PP2A内源性抑制剂SET基因的不同部位,构建靶向SET的shRNA真核表达质粒,鉴定并筛选出佳抑制效率的表达质粒.方法:针对SET基因的不同部位设计4对短发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸片段,克隆到真核表达载体pGPU6中,构建靶向SET的shRNA真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-SET-shRNA-1、2、3、4.利用脂质体转染人胃癌细胞株BGC-823,Western blot法检测并筛选佳抑制效率的shRNA表达质粒.结果:4个靶向SET的shRNA真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-SET-shRNA-l、2、3、4经限制性酶切和测序证实基因已正确插入,荧光显示转染效率可达到80％以上.Western blot法证实pGPU6/GFP/Neo-SET-shRNA-3明显降低BGC-823细胞内SET蛋白的表达.pGPU6/GFP/Neo-SET-shRNA-3对SET蛋白表达的抑制效应在72h达到强.结论:成功构建靶向SET的shRNA真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-SET-shRNA-1、2、3、4,并筛选出佳抑制效率的表达质粒,为今后研究SET在胃癌中的作用机理奠定了基础.
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CIP2A与肿瘤关系的研究进展
蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(CIP2A)是近被识别的一种癌蛋白.研究表明CIP2A具有稳定c-Myc蛋白表达水平,促进细胞锚着非贴壁性生长与体内肿瘤形成的作用.CIP2A在人类头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、胃癌及结肠癌中高表达.但目前CIP2A在人类癌症发生发展过程中的作用机制及临床相关性仍不十分清楚,有待进一步深入研究.
关键词： 蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子 c-myc 蛋白磷酸酶2A -
基底细胞样乳腺癌组织CIP2A蛋白表达临床意义分析
目的:检测蛋白质磷酸酶2A(PP2A)的癌性抑制因子(CIP2A)在基底细胞样乳腺癌(BLBC)中的表达,分析CIP2A与BLBC临床病理特征的关系.方法:采用免疫组化方法检测43例BLBC、57例non-BLBC和20例癌旁正常乳腺组织中CIP2A蛋白的表达.结果:免疫组化检测结果显示,BLBC及non-BLBC中CIP2A的表达明显高于癌旁正常乳腺组织,差异有统计学意义,P＜0.05; CIP2A蛋白的表达和患者年龄及肿瘤大小无关,与BLBC淋巴结转移及临床分期相关,P＜0.05.结论:BLBC组织高表达CIP2A,CIP2A可能与BLBC的发生、发展密切相关.
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缺血性卒中患者血浆葡萄糖脑苷脂酶和蛋白磷酸酶2A及神经酰胺水平的变化
目的：分析缺血性卒中患者血浆葡萄糖脑苷脂酶（GBA）、蛋白磷酸酶2A（PP2A）及其降解产物神经酰胺的改变。方法回顾性纳入2013年5月至9月武警后勤学院附属医院神经内科急性缺血性卒中住院患者45例，另收集同期年龄和性别相匹配的45名体检中心的健康者为对照组。采集患者和健康受试者静脉血，抗凝分离血浆。采用蛋白质芯片H50和激光解析电离飞行时间质谱方法测试血浆神经酰胺水平。结果缺血性卒中患者血浆GBA和PP2A水平均明显低于对照组，缺血性卒中组和对照组的GBA水平分别为（2.4±0.8）、（13.1±1.4）U／L，差异有统计学意义（P＜0.05），而PP2A水平分别为（6.5±2.8）、（14.5±4.7）U／L（P＜0.01）。缺血性卒中患者血浆神经酰胺相对量为1.9±0.7，明显低于对照组的12.2±5.0（P＜0.01）。结论缺血性卒中患者血浆GBA和PP2A以及神经酰胺水平均降低，提示卒中患者血液中α-突触核蛋白的异常磷酸化。
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蛋白磷酸酶2A活性调节机制及其在阿尔茨海默病中的作用
蛋白磷酸酶2A（PP2A）是脑内主要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶，参与细胞内多种生理和病理过程，尤其在阿尔茨海默病（AD）中，PP2A与AD的主要病理特征密切相关。PP2A活性的下调会增加tau蛋白的过度磷酸化、促进淀粉样前体蛋白的形成、增加神经元的缺失。以PP2A为靶点的药物研发，可能为AD治疗带来新的希望。本文对PP2A结构、活性调节及其在AD发病中作用的研究进展进行了综述。
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去甲斑螯素诱导的PP2A的抑制对提高CNE1的放射活性的影响
目的 研究去甲斑螯素所诱导的蛋白磷酸酶2A(PP2A)的抑制对鼻咽癌细胞系CNE1及其裸鼠移植瘤放射增敏的影响.方法 采用免疫共沉淀、流式细胞术等方法探讨去甲斑螯素(40 μmol· L-1)或(和)放射处理(8 Gy)对鼻咽癌细胞CNE1及其裸鼠移植瘤PP2A活性、细胞周期、凋亡的影响情况,研究去甲斑螯素抑制PP2A后于放射作用下所诱导的鼻咽癌细胞CNE1及其移植瘤组织生物学现象的变化.结果 去甲斑螯素协同放射处理相比较其他各处理组,G2/M期细胞显著聚集增多(45.71±2.015)％,凋亡率也明显提高(75.63±6.11)％,裸鼠移植瘤抑瘤率达到87.64％.结论 PP2A的抑制显著诱导鼻炎癌细胞的凋亡与延迟移植瘤的生长,其很有可能成为提高鼻咽癌放射增敏作用的新靶点.
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山茱萸环烯醚萜苷对蛋白磷酸酶2A催化亚基C磷酸化的调节机制
目的 探讨山茱萸环烯醚萜苷(Cornel iridoid glycoside,CIG)上调蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A,PP2A),PP2A活性抑制tau蛋白磷酸化的作用机制.方法 ①确定佳转染条件:将Src质粒DNA(0.2、0.4、0.6、0,8 μg)瞬时转染入小鼠神经瘤母细胞(Neuro-2A cell,N2a细胞),观察不同量Src对PP2A催化亚基C磷酸化和tau蛋白磷酸化的影响;②将0.6μg Src质粒DNA转染入N2a细胞,24 h后加入CIG(50、100、200 μg/mL)共同孵育24 h,观察CIG对Src、蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(proteintyrosine phosphatase 1B,PTP1B)、p-PP2Ac及tau蛋白磷酸化的作用.结果 ①转染Src(0.2、0.4、0.6 μg)质粒DNA到N2a细胞,Src蛋白表达明显增加,p-PP2Ac水平上调,PP2Ac蛋白总量表达无变化,tau蛋白在Ser 199/202、Ser396位点磷酸化显著增加;转染0.8 μg Src质粒DNA到N2a细胞与转染0.6μg Src相比,p-PP2Ac表达下降,PP2 Ac蛋白总量表达无变化,tau蛋白在Ser 199/202、Ser396位点磷酸化降低.②转染0.6μg Src质粒DNA到N2a细胞,Src蛋白表达增加,p-PP2Ac表达增加,tau蛋白在Ser199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位点的磷酸化明显增加;CIG对Src蛋白表达无影响,能够抑制p-PP2Ac的表达,抑制tau蛋白在Ser 199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位点的磷酸化.此外,CIG能上调PTP1B蛋白表达.结论 CIG对Src蛋白无明显调节作用,但能通过增加PTP1B的表达,降低PP2A催化亚基C磷酸化,从而升高PP2A活性,进一步降低tau的过度磷酸化.CIG对tau蛋白过度磷酸化的抑制作用,将会给阿尔茨海默病的治疗带来广阔的应用前景.
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蛋白磷酸酶2A活力增高减轻α-突触核蛋白引起的SK-N-SH细胞凋亡
目的 观察蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)活力在α-突触核蛋白(α-Syn)引起的细胞凋亡中的作用.方法 在SK-N-SH细胞中瞬时转染空载(myc)和α-Syn质粒,免疫荧光化学方法鉴定基因表达情况.Western blotting法和PP2A酶活力检测试剂盒检测PP2A磷酸化水平及酶活力.TUNEL染色和MTT法检测各组细胞死亡情况.结果 过表达α-Syn可致磷酸化PP2A(pPP2Ac)水平显著增高及活力降低,同时导致细胞凋亡增多和细胞活力降低.PP2A激动剂C2-ceramide可显著逆转α-Syn所致细胞凋亡.结论 PP2A活力增高可减轻α-Syn过表达引起的细胞凋亡.
