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沉默CHOP基因降低衣霉素诱导的小鼠肝癌Hepa1-6细胞凋亡
目的 构建有效针对小鼠C/EBP同源蛋白(CHOP)的shRNA真核表达载体,基因沉默后对Hepa 1-6细胞凋亡的影响.方法 设计合成针对CHOP的shRNA靶序列及无同源性的shRNA序列作为阴性对照,退火后重组入pLKO.1-TRC载体,转化扩增后进行快速双酶切鉴定;慢病毒包装法转染293T细胞获得的病毒上清转染Hepa 1-6细胞,用含嘌呤霉素的培养基连续筛选10获得稳定株,Western blot检测Caspase9和c-PARP蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期.结果 各shRNA载体构建成功;与阴性对照组相比,shCHOP组能显著抑制CHOP蛋白的表达(P＜0.05);且CHOP基因沉默后明显降低了衣霉素诱导的细胞凋亡(P＜0.05).结论 CHOP基因沉默能减缓衣霉素诱导内质网应激产生的Hepa 1-6细胞凋亡.
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CIP2A shRNA真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖的抑制作用
目的：构建靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒并探讨其对胃癌细胞增殖的调节作用。方法根据siRNA原理设计4对靶向CIP2A的siRNA序列，克隆到真核表达载体pGPU6／GFP／Neo中（shRNA-1、2、3和4）。脂质体转染人胃癌细胞系BGC-823，real-time PCR和Western blot法检测并筛选佳抑制效率的shRNA表达质粒，CCK-8法检测对胃癌细胞增殖的影响。结果4个靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒经限制性酶切和测序证实基因已正确插入，转染效率可达到70％以上。转染后24、48和72 h，4个质粒均明显降低BGC-823细胞内CIP2A mRNA 和蛋白的表达。相较于其他3个重组质粒，shRNA-1的抑制作用更为显著，且对胃癌细胞增殖有明显的抑制作用（ P＜0.05）。结论成功构建的靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒，可有效抑制胃癌细胞CIP2A的mRNA和蛋白表达，并抑制胃癌细胞的增殖，为今后研究CIP2 A在胃癌中的作用机制奠定了基础。
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小鼠TRAF6基因shRNA真核表达载体的构建与表达
目的:构建并筛选肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)短发夹RNA(shRNA)表达质粒.方法:针对小鼠TRAF6 mRNA设计4条理论上佳的siRNA序列,经退火成互补双链,将相应双链DNA插入pGCsi-U6/GFP/Hygro质粒中,构建重组表达质粒pGCsi-TRAF6 -shRNA1,2,3,4,并以不同比例DNA质粒/脂质体转染重组质粒(1∶2、2∶5、1∶3和1∶4)至RAW 264.7细胞中,观察转染效果.结果:靶向TRAF6 mRNA的4个shRNA重组质粒载体pGCsi-TRAF6 shRNA1,2,3,4,经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,证实载体构建成功.应用荧光显微镜分析转染效率显示,DNA(g)/脂质体转染重组质粒(L)按1∶2、2∶5、1∶3和1∶4比例转染细胞的效率分别为13.7%±1.2%、24.5%±2.1%、19.3%±1.7%、16.3%±2.8%,以2∶5为佳比例.只加了脂质体未加质粒(试剂对照)的细胞无荧光表达.结论:TRAF6靶向RNA干扰重组表达质粒构建成功,为进一步研究阻断TRAF6表达对急性肝衰竭过度炎症反应的基因治疗奠定基础.
关键词： 肿瘤坏死因子受体相关因子6 RNA干扰 重组表达质粒 短发卡RNA -
靶向SET的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定
目的:针对PP2A内源性抑制剂SET基因的不同部位,构建靶向SET的shRNA真核表达质粒,鉴定并筛选出佳抑制效率的表达质粒.方法:针对SET基因的不同部位设计4对短发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸片段,克隆到真核表达载体pGPU6中,构建靶向SET的shRNA真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-SET-shRNA-1、2、3、4.利用脂质体转染人胃癌细胞株BGC-823,Western blot法检测并筛选佳抑制效率的shRNA表达质粒.结果:4个靶向SET的shRNA真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-SET-shRNA-l、2、3、4经限制性酶切和测序证实基因已正确插入,荧光显示转染效率可达到80％以上.Western blot法证实pGPU6/GFP/Neo-SET-shRNA-3明显降低BGC-823细胞内SET蛋白的表达.pGPU6/GFP/Neo-SET-shRNA-3对SET蛋白表达的抑制效应在72h达到强.结论:成功构建靶向SET的shRNA真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-SET-shRNA-1、2、3、4,并筛选出佳抑制效率的表达质粒,为今后研究SET在胃癌中的作用机理奠定了基础.
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靶向存活素基因短发卡RNA对人脑胶质母细胞瘤U251细胞在裸鼠体内生长的影响
目的 观察靶向存活素基因的特异性短发卡RNA(shRNA)对人脑胶质母细胞瘤U251细胞裸鼠体内肿瘤生长和血管形成的影响.方法 将U251细胞、稳定转染存活素基因shRNA真核表达载体pWH1-SR的U251细胞(U251-SR细胞)、稳定转染空载体pWH1的U251细胞(U251-P细胞),分别接种于15只裸鼠背部皮下,每组5只,观测肿瘤生长情况.采用免疫组化SABC方法检测存活素、增殖细胞核抗原(PCNA)以及第八因子相关抗原(FⅧRag)在各组肿瘤标本中的表达;采用TUNEL方法检测凋亡细胞,分别计算各组肿瘤标本的增殖指数(PI)、凋亡指数(AI)以及微血管密度(MVD).结果 与U251、U251-P组相比,U251-SR组裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及重量均明显减小(P均＜0.01);肿瘤标本存活素蛋白表达明显下调;PI和MVD明显减少,AI明显升高(P均＜0.01).结论 靶向存活素基因的shRNA能够在裸鼠体内明显抑制U251细胞的肿瘤生长和血管形成.
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RNA干扰沉默IGF1R表达对A549细胞凋亡及化疗敏感性的观察
目的:shRNA重组慢病毒感染A549细胞沉默IGF1R基因,观察其对A549细胞凋亡及紫杉醇化疗敏感性的影响.方法:构建IGF1R-shRNA-LV重组慢病毒,并以MOI=20感染A549细胞,评价感染效果；应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测IGF1R干扰效果；蛋白质印迹检测pro-Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Fas和FasL蛋白相对表达量,Hoechst 33258法检测细胞凋亡形态学变化；CCK-8法检测细胞对紫杉醇敏感性变化.结果:功构建IGF1R-shRNA真核表达质粒,并包装出重组慢病毒,对照组和实验组病毒滴度分别为(1.9E+9T)和(7.0E+8T) U/mL,A549感染效率＞90％；空白对照组、阴性对照组和实验组比较,A549细胞IGF1R mRNA相对表达量分别为1.55±0.09、1.53±0.18和0.39±0.02,实验组显著下降,沉默效率为74.51％,t=11.145,P=0.000；IGF1R蛋白相对表达量分别为0.97±0.06、0.95±0.08和0.28±0.01,沉默效率为70.53％,t=33.147,P=0.000；pro-Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.62±0.02、0.64±0.02和0.35±0.04,t=5.536,P=0.006；cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.07±0.01、0.08±0.01和0.16±0.02,表明Caspase-3被大量激活、分解,促进细胞凋亡,t=-3.438,P=0.025；Fas蛋白相对表达量分别为0.41±0.06、0.43±0.07和0.88±0.03,有利于启动死亡受体凋亡途径,t=-5.756,P=0.005;Fasl蛋白相对表达量分别为0.20±0.02、0.20±0.03和0.28±0.04,组间比较差异无统计学意义,t=-1.239,P=0.283.Hoechst33258染色见实验组细胞核深染增加,凋亡细胞显著增多.空白对照组、阴性对照组和实验组紫杉醇ICso分别为55.08、54.61和18.70 ng/mL,紫杉醇敏感性显著增加.结论:构建的重组慢病毒能有效抑制IGF1R表达,诱导A549细胞凋亡,提高A549细胞对紫杉醇敏感性.
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针对Survivin基因的短发卡RNA诱导U251细胞凋亡
目的:观察针对Survivin基因的短发卡RNA(shRNA)对人脑胶质母细胞瘤U251细胞在体外凋亡的影响.方法:对U251细胞,稳定转染Survivin基因shRNA真核表达载体pWH1-SR的U251-SR细胞,以及稳定转染空载体pWH1的U251-P细胞,分别采用相差显微镜、HE染色、Hoechst染色、TUNEL染色以及透射电镜观察各组细胞的形态学特征;采用流式细胞术(FCM)定量测定各组细胞的凋亡细胞数量.结果:相差显微镜、HE染色、Hoechst染色、TUNEL染色以及透射电镜观察显示,U251-SR凋亡细胞明显增多,并呈现典型的细胞凋亡形态学改变;FCM定量分析凋亡细胞数量显示,与U251(2.1%)和U251-P(2.7%)相比,U251-SR凋亡细胞增加约6倍,达14.4%.结论:针对Survivin基因的shRNA能够在体外诱导U251细胞发生大量凋亡.
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IGF1R-shRNA重组慢病毒的构建及对肺癌A549细胞增殖的影响
目的 构建IGF1R基因的shRNA慢病毒载体,转染A549细胞鉴定沉默效率,观察其对A549细胞增殖能力的影响.方法 设计IGF1R干扰序列,与pGC-LV慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,感染A549细胞,应用RT-PCR和Western blot检测IGF1R干扰效果；细胞生长抑制实验、克隆形成实验及细胞周期检测评价其对A549细胞增殖的影响. 结果 成功构建了IGF1R-shRNA重组慢病毒并高效感染A549细胞,IGF1R mRNA及蛋白表达量分别下降74.51％,70.53％；细胞群体倍增时间显著延长,克隆形成能力显著降低,细胞周期阻滞于G0/G1期. 结论 本研究构建的重组慢病毒能显著抑制IGF1R表达,抑制A549细胞增殖.
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靶向IGF1R基因的shRNA对人肺腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用
目的 探讨靶向沉默肺腺癌A549细胞IGF1R基因表达对裸鼠移植瘤生长抑制作用及其机制. 方法 利用IGF1R-shRNA重组慢病毒、IGF1R重组慢病毒分别感染的A549细胞及未处理的A549细胞,分别构建裸鼠移植瘤模型,并命名为:实验组、阴性对照组、空白对照组.监测各组肿瘤生长情况；HE染色法观察各组移植瘤组织形态学变化,免疫组化法检测微血管密度；Western blot法检测移植瘤组织IGF1R蛋白表达水平,荧光实时定量PCR法检测HIF-1 α和VEGF基因表达水平.结果 实验组体积抑瘤率达(50.14±2.58)％,质量抑瘤率(55.53±3.11)％,肿瘤生长显著抑制；IGF1R蛋白相对表达水平较阴性对照组下降70.66％ (P ＜0.05)；实验组HIF-1 αmRNA和VEGF mRNA相对表达量(0.34±0.02、0.46±0.04)较空白对照组(0.72±0.03、1.08±0.06)及阴性对照组(0.68±0.04、1.00±0.07)显著降低(P＜0.05)；与空白对照组、阴性对照组比较,实验组肿瘤细胞稀疏,MVD明显下降. 结论 慢病毒载体介导的IGF1R shNRA能有效抑制肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长.
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CHOP基因shRNA载体构建及沉默效应
背景:研究认为,CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)通路是内质网应激介导细胞凋亡的3 条通路之一,目前国内外对内质网应激介导细胞凋亡在胃癌方面的研究较少.目的:构建针对人CHOP 基因的短发卡RNA 表达载体,观察RNA 干扰对人胃癌细胞系BGC823 细胞CHOP 基因表达的抑制作用.方法:设计CHOP 的shRNA 靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入真核表达载体pSUPER-EGFP1,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人胃癌细胞系BGC823 细胞,采用RT-PCR 和Western blotting 分别检测CHOP 基因mRNA 和蛋白表达的变化.结果与结论:把针对CHOP 基因的shRNA 的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPER-EGFP1 载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR 和Western blot 检测显示,CHOP 基因的表达水平明显降低,其中以CHOP-1 为靶序列的shRNA 沉默作用强,CHOP 的表达抑制率约67%.
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构建大鼠白细胞介素1β基因shRNA腺病毒载体
背景：特异性下调白细胞介素1β蛋白的表达可以有效缓解外周神经损伤后病理性疼痛。与siRNA相比，shRNA可以更加稳定、高效地抑制目的基因的表达，但是单纯的shRNA无法高效地进入靶细胞中发挥对目的基因的下调作用，而腺病毒载体具有宿主范围广、感染效率高以及能够在宿主细胞中稳定表达等特点。
目的：构建大鼠白细胞介素1β基因的shRNA腺病毒载体并检测其对目的基因表达的影响。
方法：根据NCBI查询获得的大鼠白细胞介素1β基因序列设计3条 siRNA 并合成相应的 shRNA，分别为shRNA1、shRNA2、shRNA3。采用3’和5’单链退火得到的shRNA片段与经过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pHBAd/U6/GFP干扰载体连接，构建白细胞介素1βshRNA腺病毒载体穿梭质粒。测序后将穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293细胞，进行白细胞介素1β基因的shRNA腺病毒载体(rAd/shRNAs)的包装与扩增，分别为rAd/shRNA1、rAd/shRNA2、rAd/shRNA3。将rAd/shRNAs感染大鼠H9C2细胞，使用荧光显微镜观察其感染效率，采用Western Blot 检测rAd/shRNAs对目的基因表达的影响。
结果与结论：测序结果显示白细胞介素1β基因的3条shRNA腺病毒载体穿梭质粒中的序列分别与所设计的3条 shRNA 序列相同；并成功构建了大鼠白细胞介素1β基因的 shRNA 腺病毒载体(rAd/shRNA1、rAd/shRNA2、rAd/shRNA3)。rAd/shRNA1、rAd/shRNA2、rAd/shRNA3均可以下调白细胞介素1β的表达，其中rAd/shRNA2的下调效果明显。 -
shRNA慢病毒载体稳定抑制LRP16表达的HepG2细胞的构建及鉴定
目的:构建LRP16基因抑制表达的HepG2稳定细胞系,鉴定其LRP16基因抑制表达的效果.方法:构建LPP-HSH008357-LVRH1GP-200短发卡RNA (shRNA)慢病毒表达载体,用该抑制表达慢病毒感染HepG2细胞系,通过荧光筛选及药筛,获得LRP16基因稳定抑制表达细胞系;终运用Q-PCR和Western blot鉴定该稳定细胞系中LRP16的表达.结果:构建了LRP16基因抑制表达及抑制表达对照的HepG2稳定细胞系,并通过Q-PCR和Western blot进行了鉴定.Q-PCR结果显示相对于对照稳转株(LPP-CSHCTR001-LVRH1GP-100),抑制表达稳转株(LPP-HSH008357-7-LVRH 1GP-200)LRP 16基因的抑制效率是4组抑制表达细胞中效果理想的一组,其抑制效率高达98％;Western blot结果也显示该抑制表达稳转株(LPP-HSH008357-7-LVRH 1GP-200)的LRP16蛋白表达量明显低于野生型HepG2细胞及对照稳转株(LPP-CSHCTR001-LVRH 1GP-100),其结果与Q-PCR一致.结论:构建并鉴定了人LRP16基因抑制表达HepG2稳定细胞系及其相应的对照稳转株.
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泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA慢病毒载体构建及其对A375细胞生物学行为的影响
目的 构建人泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA(shRNA)重组慢病毒载体,探讨其对人黑素瘤A375细胞生物学行为的影响.方法 设计并合成3条沉默Cbl-b基因的特异性shRNA及1条阴性对照shRNA,构建慢病毒载体.将A375细胞分成5组,即分别用3条特异性shRNA转染的CBLB-shRNA-1组、CBLB-shRNA-2组、CBLB-shRNA-3组,阴性对照组(阴性对照shRNA转染),空白对照组(转染空载体).应用实时荧光定量PCR和Western印迹检测转染后72 h各组A375细胞沉默效率;CCK8法检测转染后24、48、72及96 h细胞增殖能力;流式细胞仪检测转染后72 h细胞凋亡情况、细胞周期,Transwell法检测转染后72 h细胞侵袭能力.结果 成功构建3条Cbl-b shRNA慢病毒载体,Western印迹示CBLB-shRNA-3蛋白沉默效率高.CCK8检测表明,CBLB-shRNA-3组A375细胞增殖能力在转染后72 h和96 h较阴性对照组、空白对照组明显降低(均P＜0.01).流式细胞仪检测示,CBLB-shRNA-3组凋亡率[(22.73±6.58)％]明显高于阴性对照组[(6.08±1.35)％]和空白对照组[(6.34±1.07)％,均P＜0.01].CBLB-shRNA-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜ 0.01),而S期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01).Transwell检测示,阴性对照组、空白对照组和CBLB-shRNA-3组转染后72 h时穿膜细胞数分别为76.60±1.82、73.20±3.83、19.60±1.14,差异有统计学意义(F=794.50,P＜0.01).结论 成功构建能高效沉默Cbl-b蛋白的CBLB-shRNA-3重组shRNA慢病毒载体,其可促进A375细胞凋亡,抑制A375细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力.
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靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定
目的:针对β-连环蛋白(β-catenin)基因的不同部位,构建靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒,鉴定并筛选出佳抑制效率的表达质粒.方法:针对β-catenin基因的不同部位设计3对短发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸片段,克隆到真核表达载体pGPU6中,构建靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3.利用脂质体转染人胃癌细胞株AGS,Western blot法检测并筛选佳抑制效率的shRNA表达质粒.结果:3个靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3经限制性酶切和测序确实基因插入正确,Western blot法证实pGPU6-B-catenin-shRNA-3明显降低细胞内β-catenin蛋白的表达.结论:成功构建了靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3,并筛选出佳抑制效率的表达质粒,为进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中的作用奠定了基础.
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基于RNA干扰技术和microRNA调控的丙型肝炎治疗研究进展
丙型肝炎病毒(HCV)感染是一个全球性的健康问题,全球约有1.7亿人感染了HCV,慢性丙型肝炎常导致肝硬化、肝癌等严重的肝脏疾病,但至今尚无针对HCV感染的有效疫苗或抗体.RNA干扰(RNAi)是一种抵御病毒感染的具前景的治疗策略,近年来基因治疗领域的发展进一步提升了其临床应用的可行性.RNAi技术加速了对HCV生物学基础的认知,并揭示了许多可作为治疗新靶点的病毒和宿主细胞分子.同时,基因运载体系的发展以及microRNA (miRNA)在HCV感染中关键作用的发现,使得基于RNAi和miRNA的抗病毒治疗策略具有巨大前景.文中就丙型肝炎治疗的RNAi靶点,肝脏靶向基因运载体系,microRNAs抗HCV感染潜能等研究领域中的新进展作一综述.
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CXCL16基因沉默减轻ox-LDL对小鼠足细胞损伤
目的 探讨CXC趋化因子配体16(CXCL16)基因沉默在减轻氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对足细胞损伤中的作用.方法 小鼠CXCL16基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒及阴性对照慢病毒转染足细胞,Real-time PCR、Western blotting检测转染效率.CCK8法检测转染后足细胞活力.将转染后足细胞分为4组培养和处理,即阴性对照组(NC组)、ox-LDL组、CXCL16-shRNA组、ox-LDL+CXCL16-shRNA组.总胆固醇含量测定估计细胞内脂质沉积,Western blotting检测CXCL16及β1整合素变化,并检测活性氧(ROS)的表达.结果 CXCL16-shRNA慢病毒转染后,CXCL16 mRNA抑制率约70％ (P=0.008),CXCL16蛋白抑制率约60％(P=0.008).CXCL16-shRNA组及NC组细胞活力差异无统计学意义(P=0.712).ox-LDL+CXCL16-shRNA组较ox-LDL组细胞内脂质沉积减少(P＜0.001),β1整合素表达量增加(P=0.004),ROS产生减少(P＜0.001).结论 CXCL16基因沉默可减少ox-LDL作用后ROS表达量,并增加β1整合素的表达,发挥足细胞保护作用.
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靶向rPTTG的shRNA慢病毒载体构建及沉默效率评价
目的 构建并筛选能高效沉默大鼠垂体瘤转化基因(Rpttg)的shRNA慢病毒重组载体.方法 设计并合成4组特异性针对大鼠PTTG基因的sbRNA序列将其构建到慢病毒载体Pgcl-GFP中;评估慢病毒重组载体在大鼠肾细胞中的转染效率并运用real time PER技术检测各组重组载体对目的基因的沉默效果.结果 PER及测序结果显示,目的 片段插入正确,重组载体构建成功,慢病毒重组载体转染效率达70%以上;4组shRNA序列均有基因敲减效果,并且第4组sllRNA(4# shRNA)序列效果为明显(>80%).结论 成功构建了高效沉默Rpttg基因的慢病毒载体;验证了慢病毒栽体作为RNAi栽体工具转染效率的可靠性;实验显示4# shRNA能高效抑制内源性Rpt-TG基因表达.
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人MEF2C基因shRNA慢病毒载体构建及其对Daoy细胞MEF2C mRNA表达的影响
目的 构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)基因短发卡RNA (shRNA)慢病毒载体,观察其对髓母细胞瘤Daoy细胞MEF2C mRNA表达的影响.方法 设计MEF2C基因特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pGLV3/H1/GFP/Puro载体,筛选有效shRNA慢病毒载体,继而在293T细胞中包装成病毒颗粒,将其感染髓母细胞瘤Daoy细胞,Real-time PCR检测MEF2C mRNA.结果 构建的MEF2C基因shRNA慢病毒载体测序正确,包装获得的shRNA慢病毒颗粒感染Daoy细胞后其MEF2C mRNA表达量较阴性对照组下降了81.1％.结论 成功构建了MEF2C基因shRNA慢病毒表达载体并包装成慢病毒颗粒,其能够有效抑制MEF2C mRNA的表达.
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缺氧诱导因子-1α shRNA 重组质粒的构建及对人结肠癌细胞生长的影响
目的 构建靶向缺氧诱导因子-1α特异性短发卡RNA(shRNA)的真核表达载体,为结肠癌的靶向治疗奠定基础.方法 设计、合成针对缺氧诱导因子-1α的特异性短链寡核苷酸,构建缺氧诱导因子-1α特异性shRNA的重组质粒,稳定转染结肠癌SW480细胞;采用氯化钴制备缺氧诱导培养基,模拟肿瘤缺氧状态.采用实时定量聚合酶链反应和免疫印迹法检测转染前后SW480细胞中缺氧诱导因子-1α的表达;MTT法检测SW480细胞活性.结果 经酶切和测序鉴定,成功构建HIF-1α特异性shRNA的重组质粒,并能转染SW480细胞.转染后,缺氧诱导因子-1α mRNA和蛋白水平表达分别下降约86.1%和79.7%,肿瘤细胞增殖活性明显降低.结论 运用pGenesil-1质粒载体构建的靶向HIF-1α特异性shRNA的重组质粒已成功构建,该质粒可转染SW480细胞,有效抑制HIF-1α的表达;本研究可为结肠癌的靶向治疗提供新方法.
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一个编码4个不同基因RNAi的shRNA质粒的构建及其对CNE-2Z细胞增殖、凋亡和小鼠鼻咽癌移植瘤的影响
目的：构建同时表达VEGF、c-myc、survivin和hTERT基因的shRNA真核表达质粒,研究其对人鼻咽癌细胞系CNE-2Z的干扰作用。方法：根据VEGF、c-myc、survivin和hTERT基因序列,各设计2条寡核苷酸序列,合成互补DNA链,插入真核表达质粒pGenesil-1中,同时构建单基因（VEGF）质粒pGenesil-2。分别转染CNE-2Z细胞,分为多基因质粒（P-1）组和单基因质粒（P-2）组,并设空白对照（BC）组和阴性对照（NC）组。采用MTT法检测细胞增殖活性。采用实时定量PCR和Western-blot检测4种基因在人鼻咽癌细胞系CNE-2Z中的表达。体内裸鼠成瘤实验观察单基因和多基因质粒干预对肿瘤的抑制作用。结果：通过酶切和测序证实重组真核表达载体构建正确。MTT显示细胞增殖受到抑制,且多基因质粒对细胞增殖的抑制作用明显强于单基因质粒。目的基因在mRNA和蛋白水平上表达均下降。裸鼠实验显示P-1组抑制肿瘤细胞增长的作用要强于P-2组。结论：成功构建一个载体编码4个不同基因的shRNA质粒载体系统。转染鼻咽癌细胞后,与单独沉默VEGF相比,同时干扰VEGF、c-myc、survivin和hTERT基因可以更好地抑制细胞增殖。
