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反向重复序列法构建神经病靶标酯酶RNA干涉表达质粒
目的 构建基于通用真核表达载体的人神经病靶标酯酶双链RNA的稳定表达载体.方法 在正义和反义引物两端分别加上EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的识别位点扩增得到神经病靶标酯酶活力域序列,构建含有目标基因的倒置重复序列的双链RNA表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,酶切分析鉴定重组载体.脂质体法转染到Hela细胞中瞬时表达重组载体,酶活力测定其对细胞内神经病靶标酯酶活力的影响.结果 成功构建了NTE双链RNA稳定表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,表达该载体细胞内NTE活力明显下降至对照细胞的20%左右.结论 采用反向重复序列法将靶标基因的编码序列正反向插入到通用真核细胞表达载体中,是构建哺乳细胞基因双链RNA稳定表达载体的有效方法.
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RNAi抑制Survivin基因表达增加细胞凋亡
能有效抑制SURVIVIN基因的表达,caspase 3/7的活性明显增强.
关键词： RNA干涉 survivin 半胱氨酸蛋白酶3/7 -
转录后水平的基因沉默--RNA干涉
RNA干涉(RNA interference,RNAi)是1998年首次在秀丽线虫中发现并证明属于转录后水平的基因沉默(PTGS)机制.它利用双链RNA(dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA成为siRNA,从而特异性地阻断相应基因的表达,广泛存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中.本文介绍了基因沉默的机理、RNA干涉的分子机制及技术应用等方面的进展,RNA干涉在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中将具有广阔的发展前景.
关键词： PTGS RNA干涉 dsRNA 短干涉RNA(siRNA) -
寄生线虫功能基因组学的研究进展
寄生线虫病严重危害人和动物的健康,但目前防治寄生线虫病尚存在困难.随着分子生物学技术的迅速发展,运用生物技术手段来控制寄生线虫病将成为可能,由此而来,研究寄生线虫的基因功能具有非常重要的意义.本文简要概述了研究寄生虫功能基因组学的一些方法,如研究差异表达基因的方法、RNA干涉技术、寄生虫的转基因技术和生物信息学等,并综述了猪蛔虫、圆线科线虫、旋盘尾丝虫、旋毛虫、马来布鲁线虫和有齿食道口线虫等一些重要寄生线虫在功能基因组学上的研究进展.
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3种转染试剂介导siRNA转染蚊细胞的比较研究
目的 比较3种不同转染试剂介导siRNA转染蚊细胞的优缺点,选择优方法 用于转染后细胞存活率检测试验.方法 分别用FuGENE HD,X-tremeGENE和siPORT Amine 3种转染试剂介导特定siRNA转染蚊细胞,转染48 h后采用实时荧光定量PCR检测目的 基因的表达.比较3种方法 的干涉效率,转染试剂对细胞的毒性和不同方法 的操作步骤对实验结果 的影响.结果 FuGENE HD、X-tremeGENE和siPORT Amine转染后的干涉效率分别为70%、85%和29%;FuGENE HD和siPORT Amine对蚊C6/36抗性细胞毒性较小,X-tremeGENE对蚊细胞毒性较大;FuGENE HD的转染过程需要更换一次细胞培养液,X-tremeGENE的转染过程需要更换2次细胞培养液,siPORT A-mine的转染过程不需要更换培养液.结论 转染试剂的转染效果对于实验结果 有显著影响.在蚊细胞转染siRNA的实验中,FuGENE HD转染效率尚可,对细胞毒性小,转染过程只需1次换液操作;X-tremeGENE转染效率较高,对蚊细胞毒性较大,有2次换液操作;siPORT Amine毒性小且不需换液操作,但转染效率较低.综合评价:FuGENE HD更适用于转染siRNA后细胞存活率实验.
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抑制gankyrin的表达对肝癌细胞系HepG2增殖的影响
目的:探索通过RNA干涉技术抑制gankyrin的表达对肝癌细胞系HepG2增殖及细胞周期的影响.方法:建立稳定表达靶向gankyrin的shRNA的HepG2细胞系.通过Western blotting验证基因表达的抑制效果.采用细胞计数及MTT法检测细胞的增殖能力.流式细胞仪分析细胞周期.结果:抑制gankyrin基因的表达显著抑制了HepG2细胞的生长,与转染阴性对照shRNA质粒细胞相比,细胞计数示细胞数目明显减低(d6:24.4×103±5.2×103vs123.3×103±2.8×103,P＜0.05),MTT分析显示细胞增殖率明显下降(144 h:7.53±0.50vs16.30±0.38,P＜0.05),流式细胞分析示细胞周期阻滞在G1期(G1:71.63±3.60%vs52.57±2.82%,P＜0.05).结论:在HepG2细胞中抑制gankyrin的表达可有效抑制细胞生长并导致细胞周期的阻滞.利用RNA干涉技术抑制gankyrin的表达可能会成为一种有效的肝癌基因治疗手段.
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siRNA沉默STAT3基因对人肝癌细胞的抑制及对相关生长调控基因的调节
目的: 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对人肝癌细胞的抑制作用及对相关生长调控基因的调节.方法:构建pSilencer 3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒, 转染人肝癌细胞株SMMC 7721, 采用MTT法观察重组质粒对肝癌细胞的生长抑制, RT-PCR和Western blot及免疫组化法分别观察STAT3基因和蛋白水平的变化, 同时检测 survivin, c-myc, VEGF, p53, caspase3生长调控基因的mRNA, 并用流式细胞技术(FCM)及AO/EB染色方法观察细胞凋亡.结果: pSilencer 3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒对肝癌细胞的生长有抑制作用, 实验组48 h和72 h抑制率分别为59.32%, 76.49%, 与空白组及阴性组细胞相比有显著性差异(P<0.01);在重组质粒组, STAT3基因mRNA及蛋白水平表达降低, surviving, VEGF的mRNA表达下调, p53, caspase3的mRNA表达上调(P<0.01), c-myc的mRNA表达却无明显改变;重组质粒可诱导SMMC 7721细胞凋亡, 凋亡率达21.6%(P<0.01), 细胞周期分析显示细胞阻滞于G2期.结论:pSilencer 3.0-H1-STAT3-siRNA可能通过下调基因survivin和VEGF mRNA表达, 上调p53和caspase3 mRNA表达来抑制STAT3基因在人肝癌细胞中的表达.
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靶向存活素基因短发卡RNA对人脑胶质母细胞瘤U251细胞在裸鼠体内生长的影响
目的 观察靶向存活素基因的特异性短发卡RNA(shRNA)对人脑胶质母细胞瘤U251细胞裸鼠体内肿瘤生长和血管形成的影响.方法 将U251细胞、稳定转染存活素基因shRNA真核表达载体pWH1-SR的U251细胞(U251-SR细胞)、稳定转染空载体pWH1的U251细胞(U251-P细胞),分别接种于15只裸鼠背部皮下,每组5只,观测肿瘤生长情况.采用免疫组化SABC方法检测存活素、增殖细胞核抗原(PCNA)以及第八因子相关抗原(FⅧRag)在各组肿瘤标本中的表达;采用TUNEL方法检测凋亡细胞,分别计算各组肿瘤标本的增殖指数(PI)、凋亡指数(AI)以及微血管密度(MVD).结果 与U251、U251-P组相比,U251-SR组裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及重量均明显减小(P均＜0.01);肿瘤标本存活素蛋白表达明显下调;PI和MVD明显减少,AI明显升高(P均＜0.01).结论 靶向存活素基因的shRNA能够在裸鼠体内明显抑制U251细胞的肿瘤生长和血管形成.
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RNA干涉在肿瘤研究中的应用进展
RNA 干涉(RNA interference,RNAi)是生物体内的一种通过双链RNA(d ouble-stranded RNA,dsRNA)来抵抗病毒入侵和抑制转座子活动的自然机制,近来研究发现,21～25nt大小的小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)可在哺乳动物细胞中介导高度序列特异性的基因沉默,并且具有高效性和序列特异性,已经成为功能基因组研究的有力工具,并且有可能在某些疾病如肿瘤等的基因治疗中发挥重要作用.
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RNA干涉技术及其在眼科的应用
RNA干涉又称为RNA干扰,是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程,是生物体存在的一种普遍现象.美国<科学>杂志将这一新发现评为2002年度世界十大科学成就之首.本文简要介绍RNAi的基本原理、生物学意义和研究进展,并对该技术在眼部相关疾病本质揭示和防治方面应用的新进展进行综述.
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siRNA对骨肉瘤细胞细胞周期及survivin表达的影响
目的 构建人survivin特异性siRNA,探讨其对骨肉瘤细胞MG63细胞周期及survivin表达的影响.方法 构建survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系,以Western blot法检测survivin蛋白表达变化,透射电镜、Hoechst染色检测细胞凋亡情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体PsiS,获得了稳定转染的细胞系.与正常MG63细胞、阴性对照细胞相比,MG63/PsiS细胞中survivin蛋白表达减少,部分细胞核致密浓染或碎块状浓染,凋亡率增加了7倍,而G2/M期细胞减少近50%.结论 特异性siRNA能够明显抑制survivin基因在MG63细胞中的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡.
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hPLIC-2分子RNA干涉稳定细胞系的建立及鉴定
目的:建立人源性泛素类似蛋白hPLIC-2(human protein links IAP and cytoskeleton-2)knockdown稳定细胞系.方法:将RNA干涉载体稳定整合于MCF-7细胞中,建立hPLIC-2 knockdown细胞系.结果:从经抗性基因筛选的48个单细胞克隆中获得6个hPLIC-2表达被显著抑制的细胞克隆. 结论: 利用RNA干涉技术成功建立了hPLIC-2 knockdown稳定细胞系,为hPLIC-2分子的功能研究提供细胞模型.
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TLR5干涉慢病毒颗粒制备及稳定细胞系建立
目的 制备Toll样受体5(TLR5)的慢病毒干涉颗粒,建立稳定下调MyD88的HEK293细胞系.方法 将携带不同特异性干涉序列的DNA片段插入干涉质粒pSicoR中,并制备慢病毒颗粒.将慢病毒颗粒感染HEK293细胞,建立稳定细胞系,通过RT-PCR和报告基因分析的方法确定不同干涉序列对TLR5表达的下调及信号通路启动的阻断作用.结果 成功制备携带干涉序列的慢病毒颗粒,并建立稳定感染慢病毒的HEK293细胞系.与对照组相比,感染2325位序列的细胞TLR5 mRNA表达水平下降为0.32,对CBLB502的启动作用下降为0.36.结论 成功制备TLR5的慢病毒干涉颗粒,并建立TLR5稳定下调的细胞系.
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RNA干涉抑制NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达
目的:获得能有效抑制PC-1基因表达的RNAi靶标,用RNAi技术研究PC-1基因表达在前列腺癌中的作用.方法:用DNA重组技术构建了可表达短发夹RNA的重组质粒,将重组质粒与表达PC-1-EGFP融合蛋白的质粒共转染NIH3T3细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达差异,从5个候选靶标中初筛出合适的RNAi靶标,再通过RT-PCR和Western印迹从mRNA水平和蛋白质水平检测该RNAi靶标抑制PC-1基因表达的效果.结果:利用RNA干涉有效靶点抑制了NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达.结论:这一策略适合大量筛选RNAi有效靶标序列,其结果为研究RNAi技术降低PC-1基因的表达对前列腺癌细胞的影响奠定了基础.
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在2.2.15细胞中siRNA对HBV复制和表达的抑制
目的:检测设计的siRNA对HBV复制和表达的影响.方法:选择针对乙型肝炎病毒(HBV)的siRNA基因序列,化学修饰合成3种stealth siRNA,脂质体转染带有HBV的2.2.15细胞,ELISA法及荧光定量PCR检测其对HBV复制和表达的影响.结果:3种stealth siRNA对HBV的复制和表达在不同时间有不同程度的抑制作用.结论:HBV在2.2.15细胞中的复制和表达被stealth siRNA抑制.
关键词： stealth siRNA 肝炎病毒 乙型 抑制 RNA干涉 -
RNA干涉抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达
目的:通过抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达,从而部分恢复抑癌基因的表达.方法:采用RNAi技术来抑制DNMT1的活性.应用体外转录的方法,共合成了5个针对DNMT1不同靶位的siRNA序列,并转染人肺癌细胞NCI-H157.采用MSP-PCR、COBRA等方法对抑癌基因RASSF1A进行甲基化分析,半定量RT-PCR检测DNMT1 mRNA的敲降与RASSF1A基因的表达.结果与结论:5个靶位的siRNA序列中有两个靶位能够有效地抑制DNMT1的表达,且呈剂量依赖效应.人肺癌细胞NCI-H157中抑癌基因RASSF1A发生了高度甲基化,在抑制DNMT1活性后, RASSF1A基因去甲基化而恢复表达.
关键词： DNA甲基转移酶1(Dnmt1) 甲基化 RNA干涉 RASSF1A -
MyD88干涉慢病毒颗粒的包装和鉴定
目的 制备MyD88分子的慢病毒干涉颗粒,建立稳定下调MyD88的HEK293细胞系.方法 将携带特异性干涉序列的DNA片段克隆入干涉质粒pSicoR中,并制备携带不同干涉序列的慢病毒颗粒.将慢病毒颗粒感染HEK293细胞,建立稳定细胞系,经RT-PCR和报告基因分析方法确定不同干涉序列对MyD88表达的下调及信号通路激活的阻断作用.结果 成功制备携带干涉序列的慢病毒颗粒,并获得稳定感染慢病毒的HEK293细胞系,经鉴定发现感染912位序列的细胞MyD88 mRNA表达水平下调为对照组的28%,对CBLB502的激活作用下降为对照组的24%.结论 成功制备MyD88的慢病毒干涉颗粒,可用于建立MyD88稳定下调的细胞系.
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稳定低表达CD147的人肺腺癌细胞系的建立及对细胞增殖的影响
目的 构建CD147慢病毒干涉载体,建立稳定下调CD147表达的人肺腺癌A549细胞系,观察下调CD147表达后人肺腺癌细胞增殖能力的变化.方法 将携带不同特异性干涉序列的3个DNA片段分别插入干涉质粒pSicoR中,构建pSicoR-siCD147慢病毒干涉载体(pSicoR-siCD147-1,pSicoR-siCD147-2,pSicoR-siCD147-3).分别将构建好的载体转染入293FT细胞中,进行慢病毒包装.建立稳定下调CD147表达的细胞系.利用CCK-8法检测细胞增殖能力的变化.结果 与结论 构建了pSicoR-siCD147慢病毒干涉载体,RT-PCR和实时PCR结果显示pSicoR-siCD147-2的干涉效率高.建立了稳定下调CD147表达的人肺腺癌A549细胞系(A549-siCD147).CCK-8法检测发现A549-siCD147细胞的增殖能力显著性下降(P<0.05),下调CD147的表达可以使人肺腺癌细胞的增殖能力受到明显抑制.
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T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA的方法
目的:建立一种应用T7 RNA聚合酶体外转录合成大量siRNA的方法.方法:以萤火虫荧光素酶为靶标,应用T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA,脂质体转染法将其导入HepG2细胞中,通过测定荧光素酶的量,评价siRNA对萤火虫荧光素酶基因表达的抑制作用.结果:合成了以萤火虫荧光素酶为靶标的siRNA,合成的siRNA能特异性地抑制荧光素酶基因的表达,抑制率为80%.结论:建立了一种经济简便的体外合成siRNA的方法.
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