首页 > 文献资料
-
siRNA联合顺铂抑制骨肉瘤细胞增殖的研究
目的 构建人Survivin基因的siRNA真核表达载体,探讨其对骨肉瘤细胞MG63凋亡及顺铂化疗的增敏作用.方法 应用pSilencer 3.0-H1 neo,构建Survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系.半定量PCR和免疫荧光染色分别检测Survivin mRNA与蛋白的水平变化.Annexin V法检测细胞凋亡.MTT法检测顺铂对细胞的杀伤作用.结果 构建Survivin基因siRNA真核表达载体PsiS.获得了稳定转染的细胞系.与MG63、阴性对照细胞比较,MG63/PsiS生长曲线则十分平缓.MG63/PsiS细胞中Survivin的mRNA及蛋白表达明显减少.MG63/PsiS凋亡率增加为17.8%(P＜0.01).1 mg/L顺铂作用下,MG63/PsiS死亡率是其他各组的2.3倍(P＜0.01).结论 特异性siRNA能够明显阻断Survivin基因的表达促进MG63细胞凋亡,提高细胞对顺铂的敏感性.
-
Pirh2 shRNA增强肺腺癌细胞A549对顺铂敏感性的研究
目的 观察短发夹状RNA沉默泛素连接酶pirh2(P53 induced RING-H2 protein)基因表达后,肺腺癌细胞A549对顺铂敏感性及肺耐药蛋白(lung resistance-related protein, LRP)表达的变化.方法 构建靶向pirh2基因的短发夹状RNA(psiRNA-Pirh2)及阴性对照RNA(psiRNA-Con),并转染A549细胞,实时定量PCR和免疫印迹法检测A549细胞中pirh2基因和蛋白的表达变化.设立顺铂组(5 μg/ml)、psiRNA-Pirh2转染组和顺铂(5 μg/ml)+psiRNA-Pirh2组,CCK-8法检测A549细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,免疫印迹法检测肺耐药蛋白的表达,以正常A549细胞为对照.结果 psiRNA-Pirh2特异性抑制了A549细胞pirh2 mRNA和蛋白质的表达(均P＜0.05).顺铂及psiRNA-Pirh2组A549细胞增殖能力分别为正常对照组的(46.82± 6.14)%和(37.45±6.83)%,均P＜0.05,但均高于二者联合组[(28.24±6.49)%],且联合组细胞凋亡率高,达(19.8±5.1)%,S期细胞少,为(15.5±1.6)%(P＜0.05).顺铂处理组A549细胞LRP表达较正常对照组增强(P＜0.05),但联用psiRNA-Pirh2后,LRP蛋白水平有所下降(P＜0.05).结论 靶向pirh2的shRNA可特异性降低A549细胞中pirh2的表达,抑制A549细胞增殖,使其阻滞在G2/M期,诱导凋亡,下调肺耐药蛋白的表达并增强其对顺铂的化疗敏感性.
-
RNA干涉对心血管损伤过程的影响
RNA干涉也称RNA沉默,由反义RNA介导作用.反义RNA通常是一段短的非编码蛋白质的单链小分子RNA(microRNA),一般位于大分子RNA链的基因间隔区,并由其剪切而来,自身不被翻译成蛋白质,能与其互补mRNA分子特异结合而使之降解.RNA干涉可调节相关基因表达的活性,在生物体的发育过程中发挥着重要作用,该技术可能成为治疗心血管疾病的一种重要手段.
-
RNA干涉技术在基础医学中的研究进展
RNA干涉(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double stmnd RNA,dsRNA)引起的转录后基因沉默机制,具有序列特异性和高效性,RNAi作为一门新的基因阻断技术,在基础医学研究及基因治疗中具有广阔的应用前景.对RNAi作用机制及其在痰病发病机制及治疗方面的研究进展进行了概述.
-
RNA干涉技术在胶质瘤基因治疗研究中的进展
RNA干涉(RNA interfernce,RNAi)机理为利用双链RNA(dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA成为siRNA,从而特异性地阻断靶基因的表达,近对其在应用于胶质瘤基因治疗方面的研究也有进展.本文介绍了RNA干扰的分子机制、技术应用及在胶质瘤基因治疗方面的进展和广阔的发展前景.
关键词： RNA干涉 短干涉RNA(siRNA) 胶质瘤 -
人鼠同源Ⅰ型胶原siRNA及表达载体的构建
目的 针对Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链设计、构建人鼠同源的Ⅰ型胶原siRNA(COL1A1-siRNA)及其表达载体,并证实其有效性.方法 利用软件设计人鼠完全同源的一对Ⅰ型胶原siRNA序列,并构建其表达载体.直接将Ⅰ型胶原siRNA和构建的质粒转染至大鼠系膜细胞,利用KT-PCK方法观察对系膜细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的抑制作用.结果 Ⅰ型胶原siRNA转染至大鼠系膜细胞后,与空白对照组及MOCK组比较,能够抑制Ⅰ型胶原的表达.其质粒对Ⅰ型胶原表达的抑制作用更加显著,呈剂量依赖性.结论 所设计的Ⅰ型胶原siRNA为人与大鼠完全同源的siRNA序列,所有碱基完全匹配.可以成功转染到大鼠系膜细胞,并有效抑制Ⅰ型胶原在细胞内的表达.质粒载体的方法同样能够抑制Ⅰ型胶原的形成,而且表达更稳定,作用更显著.
-
ShRNA抑制gankyrin基因在肝癌细胞中表达的研究
目的构建靶向癌基因gankyrin的短发夹状RNA(shRNA),观察其在肝癌细胞株HepG2中对gankyrin基因表达的抑制作用.方法设计、合成三对针对gankyrin的shRNA序列,连接到带有人U6启动子的载体质粒pGenesil-1中,构建重组质粒pGenesil-1-Gankyrin1、pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3,稳定转染HepG2细胞,采用RT-PCR及Western blot 检测对gankyrin表达的抑制效果.结果酶切分析和测序证实pGenesil-1-Gankyrin1、pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3构建成功;其中pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3对gankyrin的表达有明显的抑制作用.结论构建的pGenesil-1-Gankyrin重组质粒能有效抑制gankyrin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达.
-
RNA干涉技术及其在病毒方面的应用
由双链RNA介导的RNA干涉(RNA interference,RNAi)又称为转录后基因沉默(post transcriptional silencing,PTGS),其实质是在生物体中导人双链RNA,特异性地降解相应序列的mRNA,从而阻断相应基因表达,即引起生物体内同源基因沉默(gene silencing).RNAi已被证明是破译各种生物中的基因功能的强大工具,并将为新型高效药物开发和基因治疗的发展开辟新的领域.
-
RNAi-生命科学的又一重大发现:2006年诺贝尔生理学/医学奖介绍
2006年10月2日,47岁的斯坦福大学教授Andrew Z.Fire和46岁的马萨诸塞州大学教授Craig C.Mello由于发现RNA干涉(RNA interference,RNAi)以及他们在基因沉默现象研究领域的杰出贡献而成为2006年诺贝尔生理学/医学奖获得者.本文概要介绍这一重大发现及其应用前景.
-
bcl-xL短发夹状RNA重组真核表达质粒对几种细胞增殖的影响
目的:以自行构建的真核表达质粒pmU6为基础,针对bcl-xL基因构建在细胞内表达短发夹状RNA(shRNA)的质粒载体,并观察它们对CNE-2Z、MCF-7和ECV-304细胞株增殖的影响.方法:将两条合成的bcl-xL寡核苷酸链插入pmU6载体中产生pmU6-RNAi重组质粒,把重组质粒转染到细胞中,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果:bcl-xL shRNA对CNE-2Z细胞株的生长增殖有明显的抑制作用,而对MCF-7和ECV-304细胞株的生长增殖无明显抑制作用.结论:提示pmU6-RNAi重组体能在细胞内表达短发夹状RNA,产生了RNA干扰效应并抑制靶细胞的生长增殖.
-
实时荧光定量PCR法检测RNA干扰后的GES-1细胞中MYCT-1基因的表达
目的 建立MYCT-1基因的实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RFQ-PCR)检测方法,检测RNA干扰(RNA interference,RNAi)后GES-1细胞中MYCT-1 mRNA 的表达水平,探讨不同剂量siRNA对MYCT-1基因的沉默效果.方法 取5×104对数生长期GES-1细胞,分别转染1 μg、2 μg、4 μg siRNA.转染第4天分别收集细胞提取总RNA,合成cDNA并进行RFQPCR检测,以未转染组作为对照.结果 加入1 μg、2 μg组MYCT-1表达量分别降低19.4%和55.2%,加入4 μg siRNA组细胞死亡.结论 成功建立了 MYCT-1基因的RFQ-PCR检测方法.加入2 μgsiRNA,脂质体与siRNA比例为4:1时,可使GES-1细胞中MYCT-1表达降低55.2%,为佳实验条件.
-
靶向Ku70重组腺病毒shRNA在C6胶质瘤细胞的表达
目的 研究重组腺病毒Ad-Ku70 shRNA对C6胶质瘤细胞系Ku70蛋白表达的影响,探讨放射治疗过程中基因增敏的新途径.方法 以穿梭质粒为基础,构建重组腺病毒Ad-Ku70 shRNA载体,扩增并鉴定其病毒滴度.然后转染至C6鼠脑胶质瘤细胞中,应用Western Blot及免疫荧光观察其Ku70蛋白的表达情况,研究重组腺病毒Ad-Ku70 shRNA对C6细胞Ku70表达的抑制效果.结果 成功构建并扩增Ad-Ku70 shRNA重组腺病毒,感染C6胶质瘤细胞后Ku70的表达明显降低.结论 Ad-Ku70 shRNA重组腺病毒载体可以明显降低C6胶质瘤细胞Ku70的表达.该结果为放射治疗基因增敏研究提供了有利的工具.
-
siRNA靶向Notch 1对U 251人脑胶质瘤细胞系生长抑制作用的体内研究
目的 研究siRNA靶向敲低Notch 1活性对裸鼠皮下U 251胶质母细胞瘤的生长抑制作用.方法 建立U 251胶质瘤细胞裸鼠皮下模型,分为:对照组、无义组siRNA转染组、Notch 1 siRNA转染组,每4 d给予siRNA、Notch1 siRNA与oligofectamin混合物瘤内治疗,直至观察期结束.处死后取出肿瘤标本,应用免疫组化检查Notch 1、PCNA、MMP9、GFAP和cyclinD1的表达水平;TuNEL法分析细胞凋亡. 结果 转染靶向Notch 1 siRNA组肿瘤生长受抑.肿瘤细胞Notch1、MMP9、cyclinD1、PCNA及表达明显下调,GFAP表达上调,细胞增殖、侵袭能力受到抑制,并诱发细胞凋亡.结论 Notch 1可作为基因治疗胶质瘤优选靶之一,RNA干涉Notch 1治疗恶性胶质瘤具有潜在的临床应用前景.
-
利用siRNA阻抑survivin基因表达诱导乳腺癌细胞系MCF-7细胞凋亡的研究
背景与目的:survivin属IAP基因家族成员,表达于多种肿瘤组织中,能促使细胞逃避凋亡,并促进细胞的异常有丝分裂.本研究旨在探讨敲除survivin基因后,癌细胞的增殖和凋亡情况.方法:利用RNAi阻抑人乳腺癌细胞内survivin基因的表达,RT-PCR和Western blot法分析survivin基因mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞生长增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:survivin siRNA转染组,survivin基因表达水平与未转染组比较下调了64%.随着siRNA浓度的增加,细胞增殖抑制率逐渐增高,200 nmol/L剂量组细胞增殖抑制率高,可达60.9%.不同浓度的siRNA可不同程度地诱导细胞凋亡,200 nmol/L剂量组凋亡率高,可达29.0%.结论:survivin siRNA有可能成为治疗乳腺癌的新药物.
-
hTERT双链RNA对肺癌细胞端粒酶的抑制作用
背景与目的:RNA干涉(RNA interference,RNAi)是基因功能研究新技术,其机制是通过双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)与靶RNA结合并将其降解.本实验探讨dsRNA对肺癌细胞端粒酶逆转录酶组分(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)抑制的可能性和特异性,了解其对肺癌细胞增殖的影响,观察其是否对真核细胞有非特异杀伤作用,探讨其在肿瘤研究和治疗方面应用的可能性.方法:RT-PCR和PCR扩增hTERT基因两个外显子和一个内含子部分序列,采用正、反义cDNA链串联形式构建dsRNA真核表达载体,转染肺癌A549细胞.RT-PCR检测hTERT mRNA表达,Western blot检测hTERT蛋白表达,TRAP法检测端粒酶活性,倒置显微镜观察细胞形态变化,绘制细胞生长曲线了解细胞增殖情况.结果:hTERT外显子的两段dsRNA作用肺癌A549细胞后,都表现出hTERT基因表达抑制、端粒酶活性下降、细胞增殖受到抑制,而且,dsRNA未引起细胞非特异死亡.结论:hTERT dsRNA能特异使hTERT基因沉默,对肺癌细胞A549端粒酶活性和细胞生长具有明显的抑制作用,有可能成为肺癌基因治疗的新方法.
-
靶向人端粒酶逆转录酶小片段干涉RNA表达载体的构建和表达
目的 构建靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小片段RNA(siRNA)表达载体,为研究RNA干涉(RNAi)在哺乳动物细胞内抑制靶基因表达奠定基础.方法 根据siRNA靶点设计的原则运用相关软件设计靶序列并合成其表达框,连接人质粒载体pRNAT-H1.1/Neo,转染293T细胞,荧光定量RT-PCR和Westemblot法检测转染后293T细胞中hTERT表达.结果 重组质粒经测序鉴定证明hTERT siRNA转录模板完整、正确插入到pRNAT-H1.1/Neo质粒中,并筛选出一个抑制hTERT表达效率高的序列,其hTERT表达仅达22.90%.结论 利用基因重组和荧光定量PCR等技术能成功构建并筛选出一个抑制效率好的靶向hTERT的siRNA表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤基因治疗的后续研究奠定基础.
-
小发夹RNA抑制Nogo基因表达促进脊髓损伤修复的实验研究
目的 利用RNA干涉(RNAi)技术使特定的基因(Nogo)沉默,探索脊髓损伤的治疗方法.方法 设计有小发夹结构的两条DNA序列,PCR扩增带有U6启动子的小发夹,腺病毒包装重组体,转染少突胶质细胞,采用Western blot法分析Nogo-66的蛋白表达水平.结果 成功地构建了靶向Nogo基因RNAi的带有U6启动子的小发夹重组体,Nogo-66蛋白表达水平明显下降.结论 靶向RNAi小发夹重组体经腺病毒包装后,成功转染少突胶质细胞并能有效抑制Nogo-66基因的表达.
-
谷胱甘肽过氧化物酶2干涉慢病毒系统构建及对人肝癌细胞凋亡的影响
目的：构建人谷胱甘肽过氧化物酶2（Glutathione peroxidase 2, GPX2）慢病毒干涉载体，获得稳定下调GPX2的高滴度慢病毒，检测敲低GPX2对细胞凋亡的影响。方法通过筛选具有显著干涉效果的siRNA序列，构建pSicoR-GPX2慢病毒干涉载体，包装病毒并感染人肝癌HepG2细胞，分别用Western-blot和RT-PCR方法检测GPX2表达情况，应用流式细胞术分析敲低GPX2对人肝癌细胞凋亡的影响。结果成功构建pSicoR-GPX2干涉慢病毒载体并获得高滴度慢病毒颗粒，GPX2蛋白表达水平和RNA表达水平均有显著下调，且人肝癌细胞感染GPX2干涉慢病毒后对凋亡更加敏感，其原因可能是促凋亡蛋白Bax的活化和抗凋亡蛋白Bcl-2活性的抑制。结论成功构建人GPX2基因干涉慢病毒，为肝癌靶标治疗提供新的线索，为后续GPX2功能研究奠定基础。
关键词： 谷胱甘肽过氧化物酶2 慢病毒 RNA干涉 凋亡 -
肿瘤多药耐药逆转剂的研究进展
多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象指肿瘤细胞如果对一种化疗药物产生耐药性,那么对其它结构和功能不同的化疗药物也产生交叉耐受的现象.肿瘤细胞的MDR现象是肿瘤治疗中常见、棘手的问题,因此要提高恶性肿瘤化疗的有效性,就必须深入研究MDR的机制以及寻求有效逆转MDR的对策.
-
RNA干涉及其在肿瘤研究中的应用
RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默的过程,是一种高效的高特异性抑制基因表达的新途径.通过双链小干涉RNA(siRNA)与一系列蛋白质结合形成siRNA诱导的沉默复合体(RISC)并活化,然后,RISC对靶基因进行识别、降解.与反义方法相比,siRNA具有更好的抑制效果.RNAi的应用将为癌症的基因治疗提供新的方法.
