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RNAi靶向沉默FLIP基因促进TRAIL诱导卵巢癌A2780细胞凋亡
目的 探讨RNAi靶向沉默FLIP基因对TRAIL诱导卵巢癌细胞凋亡的影响.方法 设计并体外化学合成FLIP序列特异性双链RNA,在脂质体(LipofectamineTM2000)介导下转染人卵巢癌细胞株A2780.采用半定量RT-PCR和Western blot法检测FLIP-siRNAs转染前后A2780细胞FLIP mRNA和蛋白表达的变化,并筛选出抑制作用强的FLIP-siRNA.四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测FLIP-siRNA转染前后TRAIL对A2780细胞生长抑制作用的变化.以Annexin-V-PI双染法流式细胞术(FCM)比较FLIP-siRNA转染前后TRAIL诱导的细胞凋亡的情况.结果 特异性FLIP-siRNA片段能有效降低A2780细胞中FLIP mRNA和蛋白水平(P<0.01),并具有时间依赖性;转染FLIP-siRNA后,TRAIL对A2780细胞的生长抑制作用明显增强(P<0.05),TRAIL诱导的细胞凋亡也显著增加(P<0.05).结论 靶向FLIP基因的siRNAs可在转录和翻译水平抑制FLIP表达,并可增加细胞对TRAIL的敏感性.
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RNA干扰:脑学习和记忆的可能机制
dsRNA介导同源靶基因沉默的RNA干扰(RNAi)是转录后基因水平沉默的主要作用方式,具有普遍的生物学意义.RNAi是dsRNA介导的核酸酶作用于dsRNA(>26nt)同源不成熟mRNA的酶解过程,mRNA降解为21-23nt的dsRNA而使基因表达沉默.RNAi所具有的特性和脑学习和记忆的特征,提示RNAi可能是RNA介导的脑记忆移转的潜在机制.
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RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因抑制Hep-2细胞生长增殖的实验研究
目的探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对Hep-2细胞生长增殖的抑制作用及诱导凋亡作用.方法根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2.随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的质粒pshRNA3.构建不表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA4.实验分为5组:A(pshRNA1)、B(pshRNA2)、C(pshRNA3)、D(pshRNA4)、E(空白培养液).酶切后电泳分析鉴定质粒pshRNA1～3.采用共聚焦显微镜检测质粒转染后细胞荧光表达情况;以蛋白印迹法研究hTERT表达变化;以TRAP-PCR ELISA 法研究端粒酶活性变化;以四甲基偶氮唑盐(MTT)法、倒置相差显微镜及原位细胞凋亡法观察各质粒抑制细胞增殖及诱导凋亡作用.结果(1)质粒pshRNA1～3 SalⅠ酶切后电泳见400 bp小带,与预期插入的目的基因大小一致.共聚焦显微镜下见大量的细胞表达绿色荧光.(2)pshRNA1、2转染细胞后hTERT表达显著降低;细胞端粒酶活性明显受到抑制,A组细胞活性为:0.159±0.039、B组细胞活性为0.163±0.028、E组细胞活性为1.512±0.076.A、B组与E组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).(3)与E组细胞吸光度(A)值比较,A、B组细胞各时间点均减小,P值均小于0.01.同等培养条件下,A、B组脱落瓶壁的死亡细胞显著增多,凋亡率明显升高.结论 (1)靶向hTERT mRNA的shRNA真核表达质粒能有效转染 Hep-2细胞;(2)RNA干扰hTERT能显著地抑制Hep-2细胞的生长增殖并诱导细胞凋亡.
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dsRNA激活PTEN基因对肺癌细胞生物活性的影响
目的 探讨双链RNA分子(dsRNA)促进肺癌细胞中PTEN基因表达后,肺癌细胞生物活性的改变.方法 根据前期研究结果,利用针对PTEN基因启动子区域非CpG岛序列的dsRNA,将其转染入肺癌肿瘤细胞A549和H292,绘制生长曲线,探讨转染后细胞增殖变化通过Transwell小室法检测侵袭能力,以及通过流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果 A549和H292细胞转染特异dsRNA分子后,与未经转染的细胞相比,PTEN基因mRNA表达量可增至4倍,但细胞的增殖、侵袭能力无显著变化.与对照组比,较多细胞停留于G1期.结论 dsRNA分子激活后可以增加PTEN基因表达,但对于其细胞功能并无显著影响.
关键词： 癌 非小细胞肺 双链RNA PTEN基因表达激活 -
RNA干扰技术抗非小细胞肺癌作用的体内实验研究
目的 探讨体外化学合成表皮牛长因子受体(EGFR)基因序列特异性双链RNA(dsRNA)在体内诱导非小细胞肺癌(NSCLC)细胞出现序列特异性基因沉默的町行性.方法 体外化学合成EGFR序列特异性dsRNA(dsRNA-EGFR),结合脂质体Lipofectamine 2000转染肺腺癌细胞株SPC-A1后,将200 μl细胞悬液接种于裸鼠,建立荷瘤鼠模型,计箅肿瘤抑制率.采用免疫组织化学技术、Western blot技术和实时逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR),检测肿瘤组织中EGFR蛋白和mRNA的表达水平.结果 dsRNA-EGFR可显著抑制体内肿瘤生长,肿瘤抑制率为75.0%,并可将EGFR蛋白表达水平降低53.6%、mRNA表达水平降低32.3%.结论 dsRNA-EGFR在体内可有效抑制NSCLC细胞中EGFR蛋白和mRNA的表达水平,抑制肿瘤生长.
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RNA干扰技术抑制A549细胞表皮生长因子受体表达的研究
目的探讨RNA干扰(RNAi)技术抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549细胞表皮生长因子受体(EGFR)表达后,对A549细胞生物学特性的影响.方法体外化学合成EGFR序列特异性双链RNA(dsRNA),用Lipofectamine 2000转染A549细胞,采用Western blot技术和流式细胞仪检测EGFR的表达,并观察A549细胞周期、集落形成、化疗敏感性等生物学特性的改变.结果序列特异性dsRNA-EGFR可显著抑制A549细胞EGFR表达;dsRNA-EGFR组细胞生长抑制率为85.0%,集落形成抑制率63.3%;细胞周期分析结果表明,dsRNA-EGFR组G0～G1期细胞数较对照组增加了12.7%,进入S期的细胞数较对照组减少了6.6%.转染dsRNA-EGFR后,可将A549细胞对顺铂的敏感性提高约4倍.结论 dsRNA-EGFR可有效抑制A549细胞EGFR的表达,并将更多的细胞阻滞在G0～G1期,抑制细胞增生,显著增加细胞对顺铂的敏感性.RNAi可能为NSCLC的基因治疗提供新策略.
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利用RNA干扰效应阻抑鼻咽癌细胞bcl-xL基因表达和诱导癌细胞凋亡的研究
目的研究RNA干扰(RNA interference)效应对人鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE-2Z bcl-xL基因表达的抑制作用及其对CNE-2Z细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用.方法使用美国Ambion公司提供的网上设计软件设计针对人bcl-xL基因的小干扰RNA(siRNA)序列,体外转录试剂盒合成siRNA;荧光素标记试剂盒标记siRNA;脂质体法将siRNA转入CNE-2Z细胞株.荧光显微镜下观察siRNA的转染效率;RT-PCR法半定量检测siRNA对bcl-xL基因表达的抑制作用;噻唑蓝法检测siRNA对细胞生长增殖抑制作用;流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用.结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见到细胞内清晰的绿色荧光,而在未转染siRNA对照组未见;各siRNA转染组bcl-xL mRNA表达水平有不同程度的下调,下调范围在10%～70%之间,而在未转染对照组内bcl-xL mRNA表达水平无明显改变;细胞生长增殖抑制率在一定范围内具有剂量依赖性(剂量增加,抑制率增高)和时间依赖性;各浓度siRNA4转染组可不同程度诱导CNE-2Z细胞凋亡.结论体外转录合成的siRNA能特异有效地下调bcl-xL基因的表达,不同序列特异性的siRNA下调bcl-xL基因表达的能力不同;瞬时转染bcl-xL siRNA4能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡;siRNA不仅为基因组功能分析提供了强有力的工具,而且为抗鼻咽癌基因治疗提供了新的思路.
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RNAi在癌症治疗中的应用
1998年,Fire等[1]发现当外源双链RNA(dsRNA)分子被注入线虫体内后能导致其同源基因沉默,他们把这种现象称为RNA干(RNA interference,RNAi).
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RNA干扰与呼吸系统疾病的治疗
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.RNAi作为一种强大的基因沉默技术,具有高效性和高特异性等特点,被广泛应用于生物医学等各个研究领域,其在呼吸系统疾病的治疗研究方面也取得了很多突破性的进展,广泛用于病毒感染、肺癌、哮喘等疾病的分子生物学机制的研究与治疗.本文对RNAi技术的发现、作用机制及在呼吸系统疾病治疗上的应用进行了综述.
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RNA干扰——一种有力的基因沉默工具
RNA干扰(RNAi)自从1998年被阐明以来,一直是科学研究的一大热点.短短几年,基于此机制建立的技术,在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机制研究等领域得到了广泛应用,已经成为一种有力的基因沉默方法.尤其对非编码RNA中的短干扰RNA与微小RNA的研究日益受到重视.本文从RNAi技术的发展、作用机制及应用等方面进行综述.
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神经元抑制性沉默元件双链RNA慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建神经元抑制性沉默元件(RE-1/NRSE)双链RNA的慢病毒载体.方法 根据RE-1/NRSE序列合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pGC-LV载体连接产生L-smRE-1/NRSE慢病毒载体,采用PCR和测序对阳性克隆进行鉴定.用L-smRE-1/NRSE和包装质粒pHelper 1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白的表达量,并计算病毒滴度,初步观察其对大鼠间充质干细胞的转染效率.结果 PCR和测序证实,构建出了RE-1/NRSE双链RNA的慢病毒载体L-smNRSE/RE-1.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为4×10~8 TU/ml.慢病毒颗粒能稳定转染大鼠间充质干细胞,当感染复数为80时,感染效率达100%.结论 成功构建了RE-1/NRSE dsRNA的慢病毒表达载体.
关键词： 神经元抑制性沉默元件 双链RNA 慢病毒载体 -
RNA干扰技术的原理与应用
1998年,Fire等[1]首次在向秀丽线虫(C.elegans)注射双链RNA(dsRNA)时发现dsRNA能够引起与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解,从而高效地特异性阻断相应基因的表达,他们把这种发生在转录后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)现象命名为RNA干扰(RNA interference,RNAi)[2].
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Toll样受体3与肿瘤免疫
Toll样受体3(TLR3)是参与天然免疫的一类重要分子,是病毒双链RNA的模式识别受体.TLR3表达于免疫细胞和某些非免疫细胞如皮肤角质化细胞、纤维母细胞和肺上皮细胞等,近年来发现人肿瘤组织中也有TLR3表达.TLR3配体双链RNA能直接激活自然杀伤细胞,增强抗原特异性CD8+ T细胞应答,促进树突状细胞的抗原呈递激活.双链RNA也能通过激活多条信号转导途径,直接诱导肿瘤细胞凋亡.TLR3激动剂作为免疫佐剂已应用到某些肿瘤的辅助性免疫治疗.TLR3在肿瘤免疫中的作用及其相关分子机制值得进一步深入研究.
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RNA干扰
RNA干扰(RNA interference,简称RNAi)现象是指,当与内源性的mRNA编码区某段序列同源的双链RNA(dsRNA)导入细胞后,该mRNA发生特异性的降解,导致该基因表达沉寂.它是生物界一种古老而且进化上高度保守的现象,由于它的简单性和快速性以及高特异和高效率的特点,已被广泛用于基因功能研究、基因治疗、和新药研究与开发等方面.
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HER-2 siRNA对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响
目的:观察表皮生长因子受体2(HER-2)siRNA转染SKOV-3细胞抑制HER-2表达后对卵巢癌细胞耐药性的影响.方法:体外转录合成HER-2序列特异性双链RNA(dsRNA),转染SKOV-3细胞株中,RT-PCR方法检测转染前后HER-2基因的mRNA的表达,MTT法检测顺铂对转染前后卵巢癌细胞的生长抑制率.结果:HER-2siRNA转染72 h后,对SKOV-3细胞HER-2 mRNA表达明显抑制.在不同浓度顺铂(0.05～50μg/ml)的作用下,转染HER-2 siRNA与转染非特异性siRNA、空白对照组相比,差异有十分显著性意义(P＜0.01).细胞对顺铂的敏感性约提高10倍.结论:体外转录合成的siRNA能有效抑制SKOV-3细胞中HER-2的表达,提高细胞对顺铂的敏感性,RNA干扰技术为卵巢癌的治疗提供了一种新策略.
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RNA干扰技术特异性抑制骨肉瘤survivin的表达
目的:体外转录合成survivin siRNA,观察其在骨肉瘤细胞株U2-OS中抑制survivin的表达情况.方法:体外转录合成survivin序列特异性双链RNA(dsRNA),转染U2-OS细胞株中,用RT-PCR和Western blot法检测转染前后survivin基因的mRNA和蛋白的表达,MTF法检测细胞增殖,观察U2-OS细胞生物学特性的改变.结果:转染特异性siRNA的细胞其survivin mRNA及蛋白表达均下调,干涉后细胞的增殖受到抑制.结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制骨肉瘤细胞株U2-OS中survivin的表达,抑制细胞的增殖,RNA干扰技术为骨肉瘤的治疗提供了一种新策略.
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重组双链RNA依赖的Caspase募集蛋白的表达、纯化及其活性
目的:表表达并纯化重组双链RNA依赖的Caspase募集蛋白,并鉴定其生物学活性.方法:将重组质粒pRSETdsCARE转化大肠杆菌BL21(DE3),分别于37、28℃表达目的蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE、Western blot、HPLC鉴定目的蛋白,MTT法检测dsCARE对转染poly(I∶C)细胞的增殖抑制作用.结果:dsCARE重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中呈组成性稳定表达,平均每升培养基可收获湿菌体约10g；纯化产物的SDS-PAGE纯度达95.8％；纯化的目的蛋白能与抗-His多抗发生特异性反应；HPLC纯度达95.1％；每10g湿菌体可纯化dsCARE重组蛋白约7.5mg,浓度约220μg/ml;纯化的dsCARE重组蛋白与转染poly(I∶C)的HeLa细胞共同孵育,可剂量依赖性抑制HeLa细胞的增殖活性.结论:成功建立了重组dsCARE蛋白的表达、纯化工艺及活性鉴定方法,为其应用和后续研究奠定了基础.
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用bcl-2反义mRNA和dsRNA抑制SP2/O生长的比较研究
目的本研究旨在比较靶向bcl-2基因的反义mRNA和dsRNA对SP2/O细胞生长的抑制作用.方法采用MTT法,免疫荧光和免疫细胞化学技术,克隆形成试验及分光光度计测定细胞总蛋白含量等方法,分析比较了经体外转录获得的bcl-2反义mRNA利LdsRNA抑制SP2/O细胞生长、bcl-2特异性蛋白和总蛋白表达及其克隆原性的作用.结果检测结果证实bcl-2反义mRNA和dsRNA对上述指标均有抑制作用,两者比较dsRNA的抑制作用更强,持续时间也较长,作为对照的bcl-2正义RNA对上述指标无显著增强作用.提示LdsRNA对bcl-2高表达的肿瘤细胞有更强的抑制和杀伤作用,因此有可能用于这些肿瘤的临床治疗.
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日本血吸虫Mago nashi蛋白编码基因功能的研究
目的 研究日本血吸虫Mago nashi蛋白编码基因在虫体生殖器官发育方面的功能.方法 体外PCR法合成Mago nashi双链RNA(dsRNA),将SjMago nashi基因dsRNA产物和阴性对照lacZ基因dsRNA产物分别电击转染至机械脱尾的日本血吸虫童虫体内,将部分电击转染的童虫作体外培养,在培养后第1、3和5天以TRIzol法同时提取其总RNA和总蛋白.实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测Mago nashi基因和蛋白表达产物.电击转染的童虫注射入6只BALB/c小鼠体内,每鼠约1 000条,6周后取出虫体,盐酸卡红染色,在激光共聚焦显微镜下观察虫体内部各器官形态特征,测量虫体相关指标.结果 在电击转染后的第1、3和5天,SjMago nashi dsRNA组目的 基因的转录水平较阴性对照组分别下降了22%、69%和80%,蛋白质水平较阴性对照组分别下降了12%、39%和56%.激光共聚焦显微镜观察发现,SjMago nashi dsRNA组中的雄虫睾丸内有较多精子,呈泛雄性化表现,而雌虫的卵巢和卵黄腺无明显特征变化.与阴性对照组相比,SjMago nashi dsRNA组的雄虫的体宽、睾丸长和睾丸宽,雌虫的体宽、卵巢长和卵巢宽均明显缩小(P＜0.05).结论 SjMago nashi dsRNA可特异性抑制日本血吸虫靶基因及其编码蛋白的表达,SjMago nashi基因为日本血吸虫生殖相关基因,在生殖系统器官的正常发育中起一定作用.
关键词： 日本血吸虫 生殖 双链RNA RNA干扰 Mago nashi基因 -
Cathepsin K基因siRNA的筛选及其质粒载体的构建
目的 筛选出对人Cathepsin K(CTSK)基因抑制效率高的1对siRNA,并通过质粒载体表达该siRNA,为进一步抑制去分化人软骨细胞中CTSK的表达奠定基础.方法 针对Cathepsin K基因设计4个靶位点,并根据靶位点合成4对siRNA,并转染人软骨细胞.通过Real-time PCR检测4对siRNA中抑制效率高的1对,与线性化的PGCsilencer-HI/Neo/GFP连接、转化、扩增与纯化质粒.结果 4对siRNA转染软骨细胞后72 h,通过对照FITC-siRNA的绿色荧光观察,siRNA的转染效率达到70%～80%.Real-time PCR检测每对siRNA的CTSK量与对照组比的百分率得到其抑制效率,分别为:第1对的比值大于对照组(无抑制作用),第2对47.5%.第3对53.1%,第4对67.3%(抑制效率大).成功构建出pGCsilencerTM H1/Neo/GFP/CTSK RNAi载体,经测序证实了克隆的RNAi打靶序列100%正确.结论 成功构建了CTSK基因的siRNAs表达质粒,为进一步研究抑制该基因表达对延缓软骨细胞的去分化过程并促进其成软骨能力奠定了基础.
