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RNA干扰研究进展
RNA干扰能使特异基因沉默,目前RNA干扰研究成为热点,并成功的在哺乳动物细胞和小鼠体内抑制部分基因的表达,本文介绍了目前RNA干扰作用机理、导入技术和应用的研究进展,可以预见RNA干扰技术在基因功能研究、细胞信号转导以及疾病的基因治疗等方面有着良好的应用前景.
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siRNAs介导的基因沉默技术和相关应用的研究进展
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默机制,是一古老的细胞反应通路,其在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥重要作用.近年来,短链RNA干扰(siRNAs)已成功地应用于哺乳动物中,该文就其介导的基因沉默技术和相关应用的研究进展进行综述.
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RNA干涉技术使基因敲低或基因静寂
介绍了RNA干涉(RNA interference,RNAi)技术的历史、作用方式、作用机制和应用前景.比较了RNAi技术使基因敲低(knock-down)或基因静寂(gene silencing)与其他技术的特点.预测RNAi技术将会被广泛应用于基因功能的研究,并有希望用于治疗某些基因过度表达或突变基因表达引起的疾病,也可抑制病毒或寄生病原性蛋白的表达.
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dsRNA激活肝癌细胞中TLR3-TRIF信号介导的凋亡作用
目的：利用RNAi技术下调Toll样受体(Toll-like receptor 3, TLR3)信号通路中β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β, TRIF)的表达，探讨双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)激活肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)细胞株(SMMC-7721)中TLR3-TRIF信号通路介导的凋亡作用。方法：分别构建靶向TRIF 的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)(siTRIF)，激活TLR3的dsRNA(BM-06)。用BM-06和BM-06联合siTRIF(BM-06+siTRIF)分别转染SMMC-7721细胞作为实验组，同时用Poly(I：C)作为阳性对照组、未处理细胞作为阴性对照组。Western Blot检测各组靶基因TRIF的表达，实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测凋亡相关基因Caspase3、8、9的表达，Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞术检测和Hoechst染色检测细胞凋亡率。结果：与未处理细胞相比，BM-06组和Poly(I：C)组中靶基因TRIF蛋白表达均显著增高(P<0.05)，凋亡相关基因Caspase3、8 mRNA水平和细胞凋亡率显著增加(均P<0.05)；Caspase9 mRNA水平略有增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；上述各结果在BM-06组和Poly(I：C)组间差异无统计学意义(P>0.05)，在BM-06+siTRIF组和未处理细胞间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：dsRNA激活HCC细胞中TLR3信号通路介导的细胞凋亡作用依赖于TRIF。
关键词： 肝细胞肝癌 双链RNA Toll样受体3 β干扰素TIR结构域衔接蛋白 凋亡 -
Toll样受体3抗乙型肝炎病毒慢性持续感染的进展
目前,HBV慢性持续感染的致病机制仍不明确,多倾向于机体对病毒产生免疫耐受,固有免疫及适应性免疫应答不佳所致.免疫调节治疗有望成为治疗HBV慢性持续性感染的重要手段.Toll样受体3(TLR3)作为病毒双链RNA(dsRNA)识别受体在机体抗病毒免疫中发挥十分重要的作用.此文将对TLR3在HBV慢性持续感染中的作用研究进展作一综述.
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RNAi技术研究进展及其基因治疗应用前景
RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象.RNAi现象在各种生物中的普遍性引起了人们浓厚的兴趣.RNAi可能将成为基因治疗的新途径.
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RNA干扰的研究进展及其应用
RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象.RNAi现象在各种生物中的普遍性引起了人们浓厚的兴趣.现对近年来RNAi的研究进展、作用机制及其应用进行评述.
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RNAi技术在药物研究中的应用
RNA干扰(RNAi)是生物界中一种既古老且在进化上又高度保守的现象,是基因转录后沉默的重要机制之一.它主要通过双链RNA(d sRNA)被核酸酶切割成21-25 nt的小RNA(siRNA)发挥作用,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现,需要有多种蛋白因子以及ATP参与,而且具有生物催化反应特征.RNAi是新发现的一种通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径,在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中具有广阔的应用前景.现将近年RNAi的研究进展作一综述.
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siRNA活性与mRNA二级结构关系的研究
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(dsRNA) 引起的基因沉默现象,它通过降解具有同源序列的mRNA 起作用,特殊设计的siRNA 能使靶基因发生特异性沉默,确定基因功能或沉默致病基因从而治疗疾病. 在RNAi技术的应用中,通常采用的是19bp长度,正、反义链3′端各有2个不配对核苷酸的双链RNA(siRNA).而合成siRNA模板的选择,即靶mRNA作用位点的选择对RNAi的作用效果的影响相当大,原因之一是因单链的mRNA存在二级结构.本研究试图从具体的实验结果出发,研究靶mRNA二级结构对siRNA活性的影响.
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RNA干扰靶向沉默FLIP基因对卵巢癌细胞A2780生物学特性的影响及生长抑制作用
目的 探讨靶向FLIP基因的小干扰RNA(siRNA)对人卵巢癌细胞A2780生物学特性的影响及生长抑制作用.方法 设计并体外化学合成FLIP序列特异性双链RNA,在脂质体(Lipofectamice TM2000)介导下转染人卵巢癌细胞株A2780.采用半定量RT-PCR和Westem blot法检测FLIP-siRNAs转染前后A2780细胞FLIP基因mRNA和蛋白表达的变化,并筛选出抑制作用强的FLIP-siRNA.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、Annexin-V-PI双染法流式细胞术(KM)分别检测FLIP-siRNA转染时A2780细胞的生长抑制作用和对凋亡的影响.结果 特异性FLIP-siRNAs 片段能有效降低A2780细胞中FLIP的mRNA和蛋白水平(P<0.01),大抑制半分别为77.4%和66.1%;转染阱siRNA后,A2780细胞的生长活力明显下降(P<0.05),RNA干扰组的细胞凋亡也显著增加(P<0.05).站论靶向FLIP基因的 siRNAs可在转录和翻译水平抑制FLIP基因表达;并可抑制卵巢癌A2780细胞生长,促进其凋亡.
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RNA干扰的研究进展
RNA干扰(RNAi)是指细胞中导入与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA(dsRNA),可致该mRNA发生特异性降解从而导致基因表达沉默的现象.因基因沉默现象发生在转录后水平,故又称为转录后基因沉默(PTGS).目前,RNAi已经成为研究基因功能的有力工具,并有望在肿瘤基因治疗、遗传性疾病以及病毒性感染治疗等方面发挥重要作用.
关键词： RNA干扰 小干扰RNA 双链RNA RNA诱导的沉默复合体 转录后基因沉默 -
RNA干扰技术研究进展
近年来对基因阻断技术的研究已有很大进展,并且已经应用于临床,显示了良好的前景.目前基因阻断主要在DNA和mRNA两个水平.
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RNA介导DNA甲基化的研究进展
RNA介导的DNA甲基化(RdDM)是RNA沉默机制之一,主要引起转录水平的基因沉默.Rd-DM主要通过dsRNA介导相同DNA序列发生重新甲基化(de novo methylation)而实现转录水平的基因沉默.RdDM需要多种相关因子、代谢酶等参与.RdDM在抗病毒,抗肿瘤方面有广阔应用的前景,并可为后基因组时代规模性基因功能研究提供有力的工具.
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RNA干扰应用新进展
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年发展起来的一种特异的靶基因失活技术,它可以象基因敲除一样非常有效地鉴定特定基因的功能.RNAi已被证明是破译各种生物中的基因功能的强大工具,并将为新型高效药物的开发和基因治疗的发展开辟新的领域.
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RNA干扰的研究进展
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene silencing,PTGS).dsRNA经核酸酶降解成21～23nt的小片段,并以其为模板,特定位点、特定间隔降解与之序列相应的mRNA.RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制.目前已成功用于基因功能和信号传递系统上下游分子相互关系的研究,有可能为肿瘤基因治疗提供新策略.
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草鱼呼肠孤病毒(GCRV)部分基因片段cDNA文库的构建
在随机六聚体引物浓度不变条件下,分别采用0.5、2、5μg 草鱼呼肠孤病毒(GCRV)单一片段RNA进行反转录cDNA合成及文库构建.结果表明,在GCRV-R NA模板浓度大于2μg时,第二链cDNA合成产物可直接通过EB染色的琼脂糖凝胶电泳进行定量及鉴定.选择cDNA与载体连接比率为5∶1,在高效电转化条件下,可获得106转化子/μg cDNA的转化效率.阳性克隆子经酶切及PCR鉴定,约45%以上的插入片段大于500bp.
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微小RNA-1236和外源性小分子双链RNA激活膀胱癌细胞p21表达作用的比较
目的 人工合成与微小RNA(miRNA,miR)-1236所作用的p21基因启动子靶序列完全互补配对的4对小分子双链RNA(dsRNA):dsP21-242、dsP21-243、dsP21-244和dsP21-245(dsP21-243序列配对程度高),分别观察其与miR-1236在激活人膀胱癌细胞株T24和EJ细胞中抑癌基因p21表达能力的差异.方法 参照小激活RNA(saRNA)的设计原则设计合成4对dsRNA.分别转染阴性对照组(dsControl)、阳性对照组(miR-1236)和实验组(dsRNA)至T24和EJ细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测p21 mRNA和蛋白表达的水平.结果 FQ-PCR检测结果显示实验组中仅dsP21-245能明显促进两种细胞中pZ1mRNA水平的升高;且与阴性对照组比较,dsP21-245分别上调T24和EJ细胞中p21 mRNA的表达至2.32倍(P＜0.01)和2.84倍(P＜0.01);与阳性对照组比较,两种细胞株中p21 mRNA的表达差异均没有统计学意义(P＞0.05).RT-PCR检测结果证实了p21 mRNA表达变化的趋势.Western blot结果显示在两种细胞株中p21蛋白表达水平的升高与p21 mRNA水平的上调一致.其余3对dsRNA均未能显著上调两种细胞株中p21基因的表达(P＞0.05).结论 人工合成的dsP21-245能显著促进膀胱癌细胞中p21的高表达,且与miR-1236激活p21表达的能力差异无统计学意义.
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siRNA沉默HIF-1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞VEGF表达的影响
目的 观察体外乏氧培养务件下食管鳞癌细胞系EC9706中HIF-1α和VEGF的表达,探讨HIF-1α在低氧条件下对食管鳞癌血管生成的调控作用.方法 CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境,RT-PCR、免疫组化法和免疫印迹法分别检测缺氧状态下HIF-1α和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达.采用化学合成小干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰技术(RNAi)用siRNA转染EC9706细胞.观察转染后HIF-1α沉默效果.结果 低氧条件下,EC9706细胞HIF-1α mRNA水平稳定,蛋白表达显著升高,而VEGFmRNA和蛋白的表达均显著升高.SiRNA转染EC9706后能够显著下调HIF-1α的基因表达,同时VEGF基因的表达也受到明显抑制.结论 缺氧促使EC9706细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高,并通过转录激活VEGF的机制调控食管鳞癌血管生成.
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RNA沉寂及其抗病毒效应研究进展
RNA沉寂(RNA silencing)是一种新发现的、在RNA水平发挥作用的基因调控机制,以序列特异性方式降解病毒、转基因的RNA或内源性mRNA,发生于真核生物,包括在植物细胞中描述的转录后基因沉寂、真菌中的压制现象和动物细胞中的RNA干扰.RNA沉寂发挥作用的一般机制是由dsRNA启动,经Dicer酶处理成21～25 nt的小片段siRNA,作为向导序列与核糖核酸酶构成RNA诱导的沉寂复合体,降解与dsRNA同源的RNA序列,防御外来核酸序列的入侵和调节细胞内基因的表达.作为一种古老的病毒防御机制,可通过沉寂同源的病毒基因或沉寂与病毒复制有关的宿主细胞基因,在病毒感染的不同时期抑制病毒的复制.RNA沉寂的应用非常广泛,在某种意义上,RNA沉寂将会产生一场新的生物学革命.
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体外化学合成bcl-2 siRNA及脂质siPORT脂质体转染siRNA至细胞HL-60的鉴定
目的为将RNA干扰技术深入应用到血液肿瘤做铺垫,体外化学合成bcl-2小干扰RNA(small-interference RNA, siRNA)及siPORT脂质体转染siRNA至细胞HL-60的鉴定.方法通过互联网从GenBank获得人bcl-2 mRNA全序列,经扫描bcl-2 mRNA的全序列记录AA及下游19个核苷酸肽并与基因组数据库比较去除与其它基因有高度同源性的序列,选取距离AUG启动子约30个核苷酸以后的靶序列作siRNA模板的设计,且GC含量控制在30%～65%之间.选择了三条序列作为我们实验设计的靶序列并由靶序列设计合成出它们的正、反义寡核苷酸肽模板.由化学合成试剂盒体外合成双链bcl-2 siRNA,纯化并定量后用Cy3红色荧光标记,利用脂质siPORT转染试剂将bcl-2 siRNA转染入HL-60细胞,转染48 h后收集并固定细胞,荧光显微镜下观察转染结果.结果纯化的siRNA经2%琼脂糖凝胶电泳证实其长度为21 bp,说明bcl-2 siRNA被成功合成.转染Cy3标记的siRNA 48 h后的细胞荧光显微镜下经绿色光激发可见较亮的深红色荧光,而未转染bcl-2 siRNA的细胞仅有微弱的红色自发荧光.结论体外成功化学合成bcl-2 siRNA,Lipid siPORT转染试剂能将bcl-2 siRNA成功转染入白血病细胞HL-60中.
