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稳定敲低NLRP3基因的小鼠巨噬细胞系的建立与鉴定
目的:建立NLRP3炎性体缺损的小鼠巨噬细胞模型.方法:构建靶向NLRP3基因的带GFP和Neo标记的shRNA表达载体,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7后用G418抗性标记筛选稳定转染的细胞克隆,并利用GFP标记通过流式细胞仪进一步纯化,得到的细胞命名为RAWNKD.利用定量PCR检测RAWNKD细胞及其在LPS和ATP联合刺激下NLRP3基因的稳定抑制效果.结果:RAWNKD细胞GFP标记的阳性率在80%以上,NLRP3基因的抑制率超过90%,即使用LPS和ATP联合刺激NLRP3基因mRNA增加也不明显.结论:成功建立了NLRP3基因稳定敲低的小鼠巨噬细胞系,这种NLRP3炎性体缺损的巨噬细胞是探究NLRP3炎性体活化途径及其介导的炎症信号转导的有力工具.
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URI在胃癌组织的表达及对顺铂诱导的胃癌细胞凋亡的影响
目的:探讨癌蛋白非经典前折叠素RPB5相互作用因子(unconventional prefoldin RPB5 interactor,URI)在胃癌组织中的表达及其临床意义,分析URI对顺铂诱导的胃癌细胞凋亡的影响.方法:采用免疫组化辣根过氧化物酶法检测胃癌组织芯片中URI的表达,并分析其与临床特征的相关性;体外培养胃癌MGC-803细胞和SGC-7901细胞,运用Hiperfect转染试剂分别在两类胃癌细胞株中转染URI siRNA片段构建URI基因敲低细胞株,并用荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证敲低效果;将细胞分为空白组、siRNA URI干扰组以及顺铂诱导下的未转染组、无关序列组和siRNA URI干扰组,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况.结果:胃癌组织芯片检测结果显示,胃癌组织胞质中URI的表达量显著高于癌旁组织(P<0.05),胞核中URI的表达量虽比癌旁组织增高,但无显著性差异.URI的表达量与胃癌患者生存期、临床分期等无显著相关性.URI基因敲低后两类细胞株顺铂诱导的凋亡率均显著增加(P<0.01).结论:URI可能作为一种凋亡抑制因子在胃癌的发生中起作用.
关键词： 非经典前折叠素RPB5相互作用因子 胃癌 组织芯片 基因敲低 凋亡 -
RNA干涉技术使基因敲低或基因静寂
介绍了RNA干涉(RNA interference,RNAi)技术的历史、作用方式、作用机制和应用前景.比较了RNAi技术使基因敲低(knock-down)或基因静寂(gene silencing)与其他技术的特点.预测RNAi技术将会被广泛应用于基因功能的研究,并有希望用于治疗某些基因过度表达或突变基因表达引起的疾病,也可抑制病毒或寄生病原性蛋白的表达.
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环氧合酶-2基因敲低对足细胞凋亡及nephrin蛋白表达的影响
目的 观察足细胞环氧合酶-2( COX-2)基因敲低对足细胞凋亡及nephrin蛋白表达的影响.方法 (1)以条件永生性小鼠足细胞株为研究对象:分为正常对照组、5μl的siRNA组、10μl的siRNA组、15μl的siRNA组.经诱导分化成熟,在干扰48 h后用半定量RT-PCR和Western bolt分别检测COX-2 mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞仪检测足细胞凋亡水平.(2)以10μl的siRNA组作为研究对象,分别设立足细胞正常对照组、足细胞COX-2基因敲低组和足细胞阴性转染对照组,用Western bolt检测nephrin蛋白、BAX蛋白及BCL-X1蛋白的表达水平.结果 (1)与正常对照组比较,随着干扰浓度的增加,COX-2mRNA及蛋白表达逐渐减少,而足细胞的凋亡率逐渐升高,15 μl的siRNA组凋亡率明显增高.(2)1μl COX-2 siRNA转染组nephrin蛋白表达显著低于阴性转染组(P＜0.05).(3)与阴性转染组相比,10μlCOX-2 siRNA转染组Bax蛋白表达显著上调,而Bcl-xl蛋白表达稍有下调.结论 敲低COX-2的基因表达可以导致足细胞凋亡,并随着干扰浓度的增加,足细胞凋亡率逐渐增加；在干扰浓度为10μl时,足细胞nephrin蛋白的表达下调；BAX蛋白上调及BCL-X1蛋白下调参与了足细胞的凋亡.
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环氧合酶-2基因敲低对足细胞凋亡及podocin蛋白表达的影响
目的 观察足细胞环氧合酶-2(COX-2)基因敲低对足细胞凋亡及podocin蛋白表达的影响,以进一步探讨足细胞凋亡的分子机制.方法 将条件永生性小鼠足细胞株随机分为阴性转染组、5 μL siRNA组、10 μL siRNA 组、15 μL siRNA组.经诱导分化成熟,在siRNA干扰48 h后用半定量RT-PCR和Western bolt分别检测足细胞COX-2 mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞仪检测足细胞凋亡水平.将10 μL siRNA组分别设立足细胞正常对照组、足细胞COX-2基因敲低组和足细胞阴性转染对照组三个亚组,用Western bolt检测podocin蛋白、BAX蛋白及BCL-X1蛋白的表达水平.结果 与阴性转染组比较,随着干扰浓度的增加,COX-2 mRNA及蛋白表达逐渐减少,而足细胞的凋亡率逐渐升高,15 μL的siRNA组凋亡率明显增高.足细胞COX-2基因敲低组podocin蛋白表达显著低于足细胞阴性转染对照组(P＜0.05).与足细胞阴性转染对照组相比,足细胞COX-2基因敲低组BAX蛋白表达显著上调,而BCL-X1蛋白表达稍有下调.结论 敲低COX-2基因表达可以导致足细胞凋亡,且随着siRNA干扰浓度的增加,足细胞凋亡率逐渐增加.在干扰浓度为10μL时,足细胞podocin蛋白的表达下调.BAX蛋白上调及BCL-X1蛋白下调参与了足细胞的凋亡.
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SIRT1基因敲低增强HepG2细胞对单壁碳纳米角的敏感性
目的:探讨SIRT1基因敲低增强HepG2细胞对单壁碳纳米角(Single-Walled Carbon Nanohorns,SWNHs)的敏感性.方法:通过在HepG2细胞中建立过表达和敲低SIRT1的细胞株,流式细胞检测不同SIRT1表达水平对HepG2细胞周期的影响;采用不同浓度SWNHs对HepG2细胞进行处理,CCK-8法评估HepG2细胞对SWNHs的敏感性;采用Westernblotting探索SIRT1影响HepG2细胞凋亡的机制.结果:获得低表达si-SIRT1和高表达pLV-SIRT1细胞株,发现si-SIRT1组细胞周期阻滞,并且有(14.94±1.22)％细胞出现凋亡,HepG2组和pLV-SIRT1组细胞凋亡率分别为(5.43±0.34)％和(4.49+0.34)％,si-SIRT1组与之相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);SIRT1基因敲低增强HepG2细胞对SWNHs的敏感性,低表达si-SIRT1组的数据显示,低浓度SWNHsl0在24h后si-SIRT l-HepG2细胞的活性下降到(43.22±2.21)％,而大剂量SWNHs40在48 h后si-SIRTl-HepG2细胞的活性下降到(2.02±0.13)％,与对照组(HepG2组)相比差异具有统计学意义(P＜0.05);通过Western-blotting验证,si-SIRT1组的P53表达增高,其相关下游凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-7也出现高表达.结论:通过敲低SIRT1后HepG2细胞周期阻滞,对SWNHs的敏感性显著增强,SWNHs有望成为一种有效的生物治疗肝癌的新方法.
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通过基因敲低探讨多个足细胞分子作用及分子间反应
目的研究足细胞裂孔隔膜(SD)复合体分子nephrin、podocin和CD2AP,以及足细胞骨架蛋白α-辅肌动蛋白(actinin)-4的作用及分子间反应.方法针对nephrin、podocin、CD2AP和α-actinin-4 mRNA序列分别设计并构建2个特异RNA干扰质粒-psiRNA-hH1GFPzeo,分别导入小鼠足细胞系MPC5以"敲低"其表达.免疫荧光染色观察其分布方式.半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测其mRNA和蛋白表达.结果(1)podocin敲低组(siPod966和siPod54):未检测到podocin及nephrin mRNA,其蛋白分别下降了92%、79%及82%、67%.而CD2APmRNA和蛋白分别增加了62%、42%及71%、46%.α-actinin-4无变化.(2)nephrin敲低组(siNep492):未检测到nephrin mRNA和蛋白.而CD2AP mRNA和蛋白分别增加了35%、48%.podocin和α-actinin-4无变化.(3)CD2AP敲低组(siCda744和siCda21):未检测到CD2APmRNA,其蛋白分别下降了92%和83%.nephrin mRNA和蛋白分别下降了60%、48%及76%、72%;而podocin mRNA和蛋白分别增加了38%、22%及56%、44%.α-actinin-4无变化.(4)α-actinin-4敲低组(siAct1790和siAct319):α-actinin-4和nephrin的mRNA分别下降了69%、58%及64%、49%;蛋白分别下降了81%和55%以及71%、64%.而podocin以及CD2AP mRNA分别增加了50%、34%及45%、28%;蛋白分别增加了64%、46%及65%、42%.(5)敲低nephrin、podocin和CD2AP后,这些表达量降低的分子的分布发生了明显改变,即以核周为主;而相应分子敲低后引起的podocin和CD2AP表达增加,其分布亦主要以核周染色增强为主.α-actinin-4即使表达降低,分布亦无变化,仍呈细丝状分布于胞质及足细胞伸出的突起中.结论(1)在SD复合体分子中,nephrin可能具有相对独立的作用.(2)a-actinin-4对nephrin、podocin和CD2AP有直接或间接的作用.(3)足细胞分子间的作用和联系不总是"一致的",可能是"单向的"、也可能是"双向的".(4)nephrin、podocin、CD2AP和α-actinin-4在足细胞的分布有赖于其表达量的正常及正常的分子间反应.
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敲低Aurora A基因增强替莫唑胺抗人脑胶质瘤U87细胞的作用
目的 探讨敲低AuroraA基因对替莫唑胺抗人脑胶质瘤U87细胞的作用.方法 以慢病毒介导Aurora A shRNA转染高表达AuroraA基因的U87人脑胶质瘤细胞敲低其表达;转染后荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR、Western blot分别检测Aurora-A mRNA及蛋白表达；证实转染成功后,以不同浓度梯度替莫唑胺作用于未转染组、空载体组和转染组3组细胞,每组5个平行孔,并设空白对照及阴性对照,作用一定时间后用CCK8法测定替莫唑胺对细胞增殖影响；流式细胞仪测替莫唑胺对细胞周期的影响.结果 荧光显微镜下可见转染组及空载体组细胞带绿色荧光；未转染组、空载体组和转染组的RT-PCR和Western blot结果灰度值分别为(31023±926)、(30124±1074)、(896±172)和(39556±2306)、(39348±2738)、(574±96).相对于空载体组和未转染组,转染组的Aurora A mRNA和蛋白表达均降低(P＜ 0.001)；未转染组、空载体组和转染组的半数有效抑制浓度(IC50)分别为:(43.38±2.15) μmol/L、(43.76±1.52)μmol/L、(22.20±2.34) μmol/L,转染组替莫唑胺半数有效抑制浓度(IG0)降低(P＜0.01)；替莫唑胺处理的转染组G2/M期细胞百分数(88.01％±7.35％)高于空载体组(59.28％±6.76％)和未转染组(58.35％±5.98)(P＜ 0.01),与对照的相同细胞株相比GVM期均延长(P＜0.01).结论 敲低AuroraA基因表达可增强替莫唑胺抗人脑胶质瘤U87细胞作用.
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子痫前期胎盘中Gadd45α的表达及敲低Gadd45α对滋养细胞HTR8/Svneo的调节作用
目的:研究子痫前期胎盘中Gadd45α的表达量及敲低Gadd45α对滋养细胞HTR8/Svneo的调节作用.方法:收集子痫前期胎盘组织和正常胎盘组织,分别采用荧光定量PCR法和免疫印迹法检测Gadd45α的mRNA含量和蛋白含量;培养滋养细胞HTR8/Svneo,转染Gadd45α的siRNA后检测细胞的侵袭能力及侵袭相关分子的表达量.结果:子痫前期胎盘组织中Gadd45α的mRNA含量和蛋白含量高于对照组;转染Gadd45α的siRNA后,HTR8/Svneo细胞中Gadd45α的mRNA含量和蛋白含量均明显降低,侵袭细胞的数目以及MMP1、MMP2、MMP3、MMP9的表达量均明显增加.结论:子痫前期胎盘中Gadd45α的表达量异常升高;抑制滋养细胞HTR8/Svneo中Gadd45α的表达量能够促进的侵袭、增加MMPs分子的表达.
关键词： 子痫前期 生长阻滞和DNA损伤45α 基因敲低 基质金属蛋白酶 -
环氧合酶-2基因敲低对足细胞相关蛋白表达的影响
目的：观察足细胞环氧合酶-2（COX-2）基因敲低对足细胞相关蛋白表达的影响。方法：以条件永生性小鼠足细胞株为研究对象，分为足细胞正常对照组、足细胞COX-2基因敲低组和足细胞阴性转染组，用流式细胞仪检测足细胞凋亡水平，用 Western bolt 检测COX-2、Nephrin、Podocin、CD2相关蛋白（CD2AP）的表达水平。结果：与足细胞正常对照组及阴性转染组相比，足细胞COX-2基因敲低组COX-2蛋白表达明显降低、细胞凋亡率明显增高，而 Nephrin、Podocin、CD2AP蛋白表达则显著降低。结论：足细胞 COX-2基因敲低可以导致足细胞凋亡，且足细胞Nephrin、Podocin、CD2AP蛋白的表达下调。
