首页 > 文献资料
-
Cathepsin K基因siRNA的筛选及其质粒载体的构建
目的 筛选出对人Cathepsin K(CTSK)基因抑制效率高的1对siRNA,并通过质粒载体表达该siRNA,为进一步抑制去分化人软骨细胞中CTSK的表达奠定基础.方法 针对Cathepsin K基因设计4个靶位点,并根据靶位点合成4对siRNA,并转染人软骨细胞.通过Real-time PCR检测4对siRNA中抑制效率高的1对,与线性化的PGCsilencer-HI/Neo/GFP连接、转化、扩增与纯化质粒.结果 4对siRNA转染软骨细胞后72 h,通过对照FITC-siRNA的绿色荧光观察,siRNA的转染效率达到70%～80%.Real-time PCR检测每对siRNA的CTSK量与对照组比的百分率得到其抑制效率,分别为:第1对的比值大于对照组(无抑制作用),第2对47.5%.第3对53.1%,第4对67.3%(抑制效率大).成功构建出pGCsilencerTM H1/Neo/GFP/CTSK RNAi载体,经测序证实了克隆的RNAi打靶序列100%正确.结论 成功构建了CTSK基因的siRNAs表达质粒,为进一步研究抑制该基因表达对延缓软骨细胞的去分化过程并促进其成软骨能力奠定了基础.
-
人 Smad 4基因在胶质瘤细胞中的作用研究
目的：构建人 Smad 4基因质粒体并检测其在胶质瘤细胞系 U251内的表达水平及作用。方法构建 PEGFP-Smad4质粒体,应用 FUGENE HD 转染质粒体进入 U251,G418筛选,挑出单克隆扩增,建立稳定细胞株 N1-U251和 Smad4-U251。将实验分为空白组(U251细胞)、N1组(空质粒-U251)、Smad4组(Smad4-U251),检测 Smad4基因和蛋白表达水平；使用 CCK8法检测空白组、N1组、Smad4组细胞活性。使用流式细胞术检测细胞凋亡率,使用免疫印迹技术检测 Caspase 3与 p-Histone H3蛋白表达水平。结果PEGFP-Smad4质粒体构建成功,N1-U251,Smad4-U251稳定细胞株构建成功,CCK8显示空白组、N1组、Smad4组细胞活性分别是1±0.03、0.95±0.04、3.22±0.13,Smad4组与 N1组比较,差异明显(P <0.05),免疫印迹显示高表达 Smad 4组 pHistoneH 3表达水平明显增高；空白组、N1组、Smad 4组在经替莫唑胺化疗处理后细胞凋亡率分别为0.36±0.09、0.38±0.11、0.21±0.03,Smad 4组与 N1组比较,差异明显(P <0.05)；免疫印迹显示高表达 Smad 4组 Caspase 3表达水平明显降低。结论成功构建人 Smad4质粒体并建立高表达 Smad4的细胞系,高表达 Smad4可以提高 U251细胞活性,降低化疗敏感性。
