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针对miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与检测
目的:构建携带人miR-221基因的miRNA干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法.方法:合成含干扰序列的双链DNA oligo直接连入酶切后的RNA干扰载体上.将产物转入细菌感受态细胞.对长出的克隆进行PCR鉴定,阳性克隆即为目的基因RNA干扰慢病毒载体质粒.再将目的基因与目的载体分别进行双酶切.纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒栽体,然后将两种质粒共转染入293T细胞,用western bolt法检测其有效敲减靶序列.结果:重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576的靶点干扰效果好.结论:本实验成功构建了人miR-221基因的RNA干扰慢病毒栽体,并找到了有效的干扰靶序列.
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miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与表达检测
目的 构建携带人miR-221 基因的miRNA 干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法.方法 合成含干扰序列的双链DNA oligo 直接连入酶切后的RNA 干扰载体上.将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR 鉴定,阳性克隆即为目的 基因RNA 干扰慢病毒载体质粒.再将目的 基因与目的 载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR 鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T 细胞,用western bolt 法检测其有效敲减靶序列.结果 重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576 的靶点干扰效果好.结论 本实验成功构建了人miR-221 基因的RNA 干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列.
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靶向人端粒酶逆转录酶小片段干涉RNA表达载体的构建和表达
目的 构建靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小片段RNA(siRNA)表达载体,为研究RNA干涉(RNAi)在哺乳动物细胞内抑制靶基因表达奠定基础.方法 根据siRNA靶点设计的原则运用相关软件设计靶序列并合成其表达框,连接人质粒载体pRNAT-H1.1/Neo,转染293T细胞,荧光定量RT-PCR和Westemblot法检测转染后293T细胞中hTERT表达.结果 重组质粒经测序鉴定证明hTERT siRNA转录模板完整、正确插入到pRNAT-H1.1/Neo质粒中,并筛选出一个抑制hTERT表达效率高的序列,其hTERT表达仅达22.90%.结论 利用基因重组和荧光定量PCR等技术能成功构建并筛选出一个抑制效率好的靶向hTERT的siRNA表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤基因治疗的后续研究奠定基础.
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RNAi-DNA表达载体的构建与应用
目的构建siRNA的DNA表达载体,为研究RNAi在哺乳动物内抑制靶基因表达奠定基础.方法合成含靶向EGFP基因的siRNA转录模板的发夹结构,将载体质粒pTZU6 +1用Sal I + Xba I进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,转染到肝癌SMMC-7721细胞中进行表达,检测转染前后EGFP表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用HindⅢ、EcoRI酶切鉴定及测序鉴定证明EGFP-siRNA转录模板完整、正确的插入到pTZU6+1质粒中,并在mRNA和蛋白水平抑制了肝癌SMMC-7721细胞中的EGFP表达.结论成功构建了siRNA的DNA表达载体,并初步应用于靶基因的抑制.
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靶向miR-221 siRNA表达载体的构建及有效靶序列的筛选和表达
目的 构建靶向miR-221的siRNA表达载体,同时筛选出一条抑制效率好的靶序列,为研究RNAi在哺乳动物细胞内抑制靶基因表达奠定基础.方法 根据siRNA靶点设计的原则运用相关软件设计靶序列并合成其表达框,连接入siRNA表达质粒pGCSIL-GFP,同时构建miR-221表达载体pEGFP-miR-221,共同转染293T细胞,Western blot检测转染后293T细胞中Flag蛋白表达,间接反映各靶序列抑制效率,后将筛选出的抑制效率好的质粒转染U87胶质瘤细胞,应用细胞增殖曲线及流式细胞仪检测其对U87细胞生长的影响.结果 重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,并筛选出1号靶序列对miR-221抑制率高,该组Flag蛋白的表达量仅为对照组的34.3%,同时该序列能有效抑制U87胶质瘤细胞的生长并诱导细胞凋亡,凋亡率达21.89%.结论 成功构建了靶向miR-221的siRNA 表达载体,并筛选出一个抑制效率好的序列,在体外实验中该序列能有效抑制U87细胞的生长.
