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实时荧光定量PCR法检测RNA干扰后的GES-1细胞中MYCT-1基因的表达
目的 建立MYCT-1基因的实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RFQ-PCR)检测方法,检测RNA干扰(RNA interference,RNAi)后GES-1细胞中MYCT-1 mRNA 的表达水平,探讨不同剂量siRNA对MYCT-1基因的沉默效果.方法 取5×104对数生长期GES-1细胞,分别转染1 μg、2 μg、4 μg siRNA.转染第4天分别收集细胞提取总RNA,合成cDNA并进行RFQPCR检测,以未转染组作为对照.结果 加入1 μg、2 μg组MYCT-1表达量分别降低19.4%和55.2%,加入4 μg siRNA组细胞死亡.结论 成功建立了 MYCT-1基因的RFQ-PCR检测方法.加入2 μgsiRNA,脂质体与siRNA比例为4:1时,可使GES-1细胞中MYCT-1表达降低55.2%,为佳实验条件.
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MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡,增殖及细胞周期的影响
目的 探讨沉默MYCT-1基因对GES-1细胞凋亡、细胞周期及细胞增殖的影响. 方法 采用siRNA转染GES-1细胞后分别应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测siRNA对细胞增殖的作用. 结果 siRNA转染GES-1细胞后,与对照细胞相比,细胞凋亡率明显增高(P＜0.05);细胞增殖率降低(P＜0.05),细胞周期检测表明细胞停滞于S期(P＜0.05). 结论 MYCT-1基因维持一定的表达水平对于正常细胞生长调控是必需的,MYCT-1基因对细胞周期的调控主要体现在S期向G1期的转变过程.
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MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定
目的 构建携带MYCT-1基因的重组慢病毒载体GV218-MYCT-1,并包装成慢病毒,为进一步研究及动物实验奠定基础.方法 MYCT-1基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得GV218-MYCT-1重组慢病毒载体并转化细菌感受态细胞.克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序并转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定.将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装,实时荧光定量PCR法检测病毒滴度.结果 DNA测序结果及Western blot鉴定证实成功构建MYCT-1重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为2×108TU/mL.结论 成功构建并包装MYCT-1重组慢病毒表达载体.
