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凋亡素选择性抗肿瘤的分子机制
凋亡素(apoptin)是一种来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子量蛋白.CAV是一种无囊膜的DNA病毒,其基因组为2300 bp的单链环状DNA分子,含有3个完全或部分重叠的开放读码框,分别编码3个蛋白质:VP1、VP2和VP3[1].VP1为主要的衣壳蛋白,相对分子质量51 600.VP2为非结构蛋白,相对分子质量24 000,其具有双重性质的磷酸酶活性并且主要与VP1相互作用.VP1与VP2为CAV复制所必需[2].VP3亦称为凋亡素,相对分子质量13 600,能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡,如骨肉瘤、肝癌、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等,而不杀伤正常细胞[1,3-5].
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携Apoptin和PEG3启动子双特异性重组腺病毒的构建及鉴定
目的 利用凋亡素基因(Apoptin)和进行性增量基因3(progression-elevated genes 3,PEG3)构建具有特异性杀伤和特异性复制功能的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a,为研究Ad-Apoptin-PEG3p-E1a的抗肿瘤作用奠定基础.方法 从pMT-E1a和pIRES-neo获得目的基因E1a和PolyA并连接入pKS-PEG3p,用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后连接入pAd-Apoptin,获得穿梭载体pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a.用pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a和腺病毒骨架质粒(pAd5)共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a,利用RT-PCR、Western blot和电镜对重组病毒进行鉴定,采用MTS检测病毒对A549细胞的抑制效果及其对L02细胞的影响;通过绘制一步生长曲线,检测重组毒在细胞内的复制情况.结果 构建的重组病毒基因组中含有Apoptin目的基因,电镜下具有正常形态.MTS检测重组腺病毒对A549细胞的抑制作用具有时效和量效关系(P＜0.05),抑制作用在100MOI、96h时达峰值为(79.84±1.0)％,对正常细胞L02无显著影响,该双特异性重组腺病毒能够在A549肿瘤细胞内复制,在L02细胞内几乎无复制能力.结论 成功包装重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a,且该病毒具有肿瘤特异性杀伤和肿瘤特异性复制功能.
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重组Apoptin的叶酸修饰及诱导肿瘤细胞凋亡活性研究
为了使重组GST-Apoptin融合蛋白能够与肿瘤细胞靶向性结合，并发挥其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，本文采用化学方法将叶酸连接到GST-Apoptin融合蛋白，实验结果表明叶酸与GST-Apoptin融合蛋白的偶联率为6%，佳偶联条件是20 mg/mL活化叶酸在pH 10.0条件下室温反应60 min。叶酸化的GST-Apoptin融合蛋白（folate-GST-Apoptin）具有显著诱导肿瘤细胞凋亡作用，1.0μg/mL的folate-GST-Apoptin可使50%的肿瘤细胞（KG-1）凋亡，而对正常人外周血淋巴细胞没有诱导凋亡作用。
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Apoptin与抗肿瘤治疗
Apoptin是来源于鸡贫血病毒的小蛋白,能诱导雏鸡造血母细胞和T淋巴细胞前体细胞凋亡,导致雏鸡出现严重的贫血及免疫功能下降.Apoptin还能诱导人肿瘤细胞和转化细胞凋亡,但对正常细胞无凋亡诱导作用.Apoptin的发现对于建立肿瘤细胞特异性治疗方法的研究具有重要意义.
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Apoptin对C6胶质瘤细胞凋亡的诱导作用
目的:探索apoptin对C6胶质瘤细胞凋亡的诱导作用.方法:构建荷C6胶质瘤Wistar大鼠的肿瘤模型,随机分为荷瘤对照组、化疗对照组和pvVP3组,给予不同的药物,通过超微结构分析、TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率,观察apoptin诱导C6胶质瘤细胞的凋亡情况.结果:pvVP3组肿瘤细胞异染色质边集,细胞核固缩,凋亡小体形成,而荷瘤对照组则未见明显凋亡改变.TUNEL法检测肿瘤细胞pvVP3组凋亡率为51.11%,明显高于荷瘤对照组(28.96%)(P＜0.01).结论:apoptin能够诱导C6胶质瘤细胞凋亡.
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Apoptin对前列腺癌细胞的促凋亡作用研究
目的 构建野生型及变异型apoptin的真核表达质粒pApoptin-EGFP、pM-apoptin-EGFP,并探讨其对人前列腺癌细胞系LNCaP、PC3的促凋亡作用.方法 采用PCR的方法从变异型apoptm质粒p3 × flag-m-apoptinmyc扩增出野生型apoption片段及变异型apoptin片段m-apoptin,将其定向克隆于pEGFP-N1载体的EcoRⅠ和Bam HI酶切位点之间,构建EGFP标记的野生及变异型apoptin真核表达质粒pApoptin-EGFP及pM-apoptin-EGFP,酶切、测序鉴定,RT-PCR、荧光显微镜分析融合蛋白表达,脂质体介导瞬时转染人前列腺癌细胞系LNCaP、PC3,流式细胞仪检测凋亡及细胞周期变化.结果 成功构建pApoptin-EGFP、pM-apoptin-EGFP重组质粒.并在被转染细胞检测到基因表达;瞬时转染后48h可检测到细胞凋亡,与空质粒组相比具有非常显著意义,细胞周期变化表现为G2/M期阻滞.结论 apoptin对雄激素依赖及非依赖型前列腺癌均具有明显的促凋亡作用,末端突变影响其促凋亡作用,为进一步探讨apoptin应用于前列腺癌的治疗奠定基础.
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Apoptin对肝癌细胞的体内、外抑制效应
目的:探讨Apoptin对人肝癌细胞株HepG-2及C57BL/6小鼠H22移植瘤的抑制作用.方法:应用脂质体转染法将重组质粒pVAX1-Apoptin转染HepG-2细胞,应用Western blotting检测Apoptin蛋白在转染后HepG-2细胞中的表达,应用MTT检测Apoptin对HepG-2细胞生长的抑制作用,通过AO/EB染色法检测pVAX1-Apoptin致肿瘤细胞凋亡作用.建立C57BL/6小鼠H22荷瘤模型,瘤内注射pVAX1-Apoptin,观察pVAX1-Apoptin对体内肿瘤的抑制作用. 结果:Apoptin基因可在HepG-2细胞中有效表达,pVAX1-Apoptin能够诱导HepG-2细胞凋亡,并显著地抑制其生长,48 h抑制率为69.28%.pVAX1-Apoptin瘤内注射能够有效抑制移植肿瘤的生长,抑制率为46.71%;治疗后39 d小鼠生存率为40%,显著高于对照组(P<0.05).结论:Apoptin转染可抑制HepG-2细胞的生长,重组质粒pVAX1-Apoptin瘤内注射对移植肿瘤有显著的抑制作用.
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Apoptin及其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制
一般认为,人类肿瘤的发生是由于细胞原癌基因的激活和/或抑癌基因的失活造成的.近年来研究表明,细胞凋亡受阻可能是肿瘤形成的重要原因之一.
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小鼠转基因Apoptin的持续表达对淋巴细胞发育和增殖的无干扰性
目的病毒来源的凋亡蛋白Apoptin诱导不同类型肿瘤细胞的凋亡而对正常细胞无损伤.通常,机体系统治疗往往因其对快速分裂细胞组织尤其是对免疫细胞体系的毒性而受到制约.因此,本文旨在研究小鼠转基因Apoptin是否在正常淋巴细胞的发育、激活和增殖过程中对其具有干扰性.方法建立H-2Kb启动子表达调控的Apoptin转基因小鼠模型.以Northern和Western印迹法分析Apoptin在转基因小鼠不同组织中的表达.以FACS方法分析Apoptin的表达对B、T淋巴细胞的细胞效应.并以脂多糖(LPS)刺激Apoptin转基因细胞和对照细胞,比较生长曲线.结果Apoptin主要表达于淋巴组织.重要的是,Apoptin不影响转基因小鼠的B、辅助T或细胞毒T细胞生长数量,提示诸细胞类型对Apoptin凋亡效应的非敏感性.蛋白酶体抑制实验表明,在这些正常细胞中,Apoptin呈短半衰期形式,该现象部分解释了Apoptin的Author's brief introduction: Alexandra Pietersen, female, born in 1974, PhDCorresponding author: Prof. Dr. Mathieu HM Noteborn (Tel : +31 71 5274211, E-mail: m. noteborn@chem. leidenuniv. nl)肿瘤特异性机制.此外,LPS对B细胞的激活或IL-2和Con A对T细胞的刺激,不导致转基因淋巴细胞的生长劣势,亦不导致细胞死亡效应的增加.结论Apoptin转基因小鼠的淋巴细胞在发育和增殖过程中对Apoptin的表达具有耐受性,为发展Apoptin的体系统肿瘤治疗消除了首要障碍.
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Apoptin特异性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制
Apoptin是一种来源于鸡贫血病毒的小蛋白,能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡,而对正常细胞无凋亡诱导作用.Apoptin的肿瘤细胞特异性与其在细胞中的亚细胞定位有关,在转化或肿瘤细胞中,Apoptin定位于细胞核,而在正常细胞中定位于细胞质.Apoptin的磷酸化决定其核定位,在肿瘤细胞中,Apoptin被磷酸化,磷酸化的Apoptin进入细胞核,并诱导细胞凋亡.Apoptin诱导的细胞凋亡不依赖p53,不为bcl-2、bcl-xL的过表达所抑制,但Apoptin诱导的快速凋亡效应需要caspase-3的活化.Apoptin具有很强的形成聚合体的倾向,在细胞内表达的Apoptin以多聚体形式存在,但多聚体的形成和解聚并不是其诱导凋亡所必需的.Apoptin诱导细胞凋亡的功能可能与其DNA结合能力密切相关.
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宫颈癌细胞中调控基因的研究进展
宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤,占女性生殖系统恶性肿瘤的半数以上,严重威胁着妇女的健康和生命,其发生发展虽然与生殖道人乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关,但 HPV 感染者并不全都进展为宫颈癌,宿主因素如致癌基因激活、抑癌基因失活等,都影响着宫颈癌的发生和发展.现将相关基因bcl-2、MDM2、TSLC1、p53以及凋亡素(apoptin)的研究进展综述如下.
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pApoptin-EGFP真核表达载体的构建及其对膀胱肿瘤T24的促凋亡作用
目的 构建真核表达质粒pApoptin-EGFP并探讨其对人膀胱肿瘤细胞株T24促凋亡作用.方法 采用PCR的方法从质粒p3×flag-Apoptin-myc扩增出野生Apoptin片段,将其定向克隆于pEGFP-N1载体的EcoRI和BamHI酶切位点,构建能表达Apoptin-EGFP融合蛋白的真核表达质粒pApoptin-EGFP,酶切、测序鉴定,RT-PCR、荧光显微镜分析Apoptin基因表达,脂质体介导瞬时转染膀胱肿瘤T24细胞,流式细胞仪检测凋亡及细胞周期变化.结果 成功构建pApoptin-EGFP重组质粒,并在被转染细胞中检测到Apoptin基因表达;瞬时转染后不同时相点均可检测到细胞凋亡,与空质粒组相比具有显著差异,细胞周期表现为G/G0期阻滞.结论 成功构建pApoptin-EGFP真核表达质粒,重组质粒能在T24细胞中顺利表达Apoptin-EGFP融合蛋白,重组质粒转染可诱导T24细胞凋亡并阻滞细胞周期于G1/G0期.
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Apoptin对宫颈癌Hela细胞放疗增敏作用实验研究
目的 探讨Apoptin增加宫颈癌Hela细胞的敏感性及作用机制.方法 应用脂质体转染方法将表达Apoptin的重组载体pEGFP-Apoptin转染入人宫颈癌Hela细胞.其中转染pEGFP-Apopti为实验组,转染pEGFP-C2组为阳性对照组,未转染组为阴性对照组.上述各组经射线干预后利用平板克隆形成实验、流式细胞术、MTT及蛋白印迹western-blot等方法分别检测细胞凋亡、周期及相关蛋白表达水平.结果 pEGFP-Apoptin在人宫颈癌Hela细胞中稳定表达.Apoptin可增加宫颈癌Hela细胞对放射线的敏感性,Apoptin可使p21、p27的表达量上调,使Rad50及Ku80的表达量下调,而对XLF的表达量则无影响.结论 Apoptin可增加宫颈癌Hela细胞的放疗敏感性,其机制可能与细胞周期阻滞及同源与非同源重组修复相关蛋白的表达水平改变有关.
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Apoptin与顺铂联用对膀胱癌T24细胞具有协同杀伤作用
目的 探讨pApoptin-EGFP质粒转染与顺铂(DDP)联用对体外培养的膀胱癌T24细胞的协同杀伤作用.方法 脂质体介导pApoptin-EGFP瞬时转染与梯度浓度DDP共同处理膀胱癌T24细胞,流式细胞仪检测细胞增殖变化;pApoptin-EGFP瞬时转染与10 μg/ml的DDP处理T24细胞,Annexin V法检测凋亡变化;金氏法分析两种抗肿瘤方式的协同作用.结果 DDP、pEGFP-N1+DDP和pApoptin-EGFP+DDP 3组的IC50分别为10.61、7.9和2.4 μg/ml,以金氏法计算,确认pApoptin-EGFP质粒转染与DDP处理对T24的抑制增殖效应具有协同作用,而转染空质粒与DDP干预仅仅为简单相加.同法检测DDP、pApoptin-EGFP、pApoptin-EGFP+DDP 3组的凋亡率分别为(6.96±1.32)%、(19.55±1.09)%和(32.5±1.15)%,3组凋亡率相互间均具有显著性差异(P＜0.05).按金氏法计算,确认转染pApoptin - EGFP重组质粒与10 μg/ml浓度DDP处理对T24细胞具有协同的促凋亡作用.结论 Apoptin基因转染与顺铂联用对T24肿瘤抑制增殖及诱导凋亡具有协同作用.
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Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达
目的 构建Apoptin的原核表达载体,并制备抗原物质Apoptin融合蛋白.方法 在获得Apoptin融合基因的基础上,成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin,将该质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的 蛋白.结果 转化有Apoptin的原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约17 000的位置出现目的 蛋白条带,大小与Apoptin融合蛋白一致.结论 Apoptin原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白,为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础.
关键词： apoptin 原核表达载体 pET-28a(+) 大肠杆菌
