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携Apoptin和PEG3启动子双特异性重组腺病毒的构建及鉴定
目的 利用凋亡素基因(Apoptin)和进行性增量基因3(progression-elevated genes 3,PEG3)构建具有特异性杀伤和特异性复制功能的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a,为研究Ad-Apoptin-PEG3p-E1a的抗肿瘤作用奠定基础.方法 从pMT-E1a和pIRES-neo获得目的基因E1a和PolyA并连接入pKS-PEG3p,用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后连接入pAd-Apoptin,获得穿梭载体pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a.用pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a和腺病毒骨架质粒(pAd5)共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a,利用RT-PCR、Western blot和电镜对重组病毒进行鉴定,采用MTS检测病毒对A549细胞的抑制效果及其对L02细胞的影响;通过绘制一步生长曲线,检测重组毒在细胞内的复制情况.结果 构建的重组病毒基因组中含有Apoptin目的基因,电镜下具有正常形态.MTS检测重组腺病毒对A549细胞的抑制作用具有时效和量效关系(P＜0.05),抑制作用在100MOI、96h时达峰值为(79.84±1.0)％,对正常细胞L02无显著影响,该双特异性重组腺病毒能够在A549肿瘤细胞内复制,在L02细胞内几乎无复制能力.结论 成功包装重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a,且该病毒具有肿瘤特异性杀伤和肿瘤特异性复制功能.
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携Apoptin和PEG3启动子双特异性溶瘤腺病毒对结直肠癌的抑制作用
目的:探讨携带凋亡素基因(Apoptin)和进行性增量基因3(progression-elevated gene 3,PEG3)启动子的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3 p-E1a对结直肠癌的体内、外抑制效果.方法:以Ad-Apoptin-PEG3 p-E1a、Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Ad-mock(均为前期工作构建)分别感染人结直肠癌SW1116细胞和胃黏膜上皮GES细胞,MTT法检测感染后细胞的增殖水平;流式细胞术检测细胞的凋亡情况;采用DCFH-DA和Rho123染色流式细胞术分别检测细胞活性氧水平和线粒体膜电位,Western blotting检测细胞色素C的释放.建立BALB/c小鼠结直肠癌CT26细胞皮下移植瘤模型,观察Ad-Apoptin-PEG3p-E1a对结直肠癌皮下移植瘤的抑制作用.结果:Ad-Apoptin-PEG3p-E1a抑制SW1116细胞增殖,并具有一定的剂效和时效关系,以MOI=100感染72 h后抑制率达到(56.23-±6.64)％,其抑制能力明显强于Ad-pEG3p-E1a和Ad-Apoptin等对照组(均P＜0.05).Ad-Apoptin-PEG3 p-E1a感染导致SW1116细胞活性氧水平上调、线粒体膜电位下降以及细胞色素C释放增加,终诱导SW1116细胞凋亡,凋亡率为(37.97±3.78)％,但对正常GES细胞的上述各项指标均无明显影响.Ad-Apoptin-PEG3 p-E1a能显著抑制小鼠皮下移植瘤生长(P＜0.05);有效延长模型动物平均生存期,Ad-Apoptin-PEG3 p-E1a治疗组平均生存期为(41.0 ±0.7)d,显著高于Ad-PEG3p-E1a的(34.4±1.6)d、Ad-Apoptin的(33.2±1.2)d和Ad-mock的(28.4±1.4)d(均P＜0.05).结论:Ad-Apoptin-PEG3p-E1a可以特异性有效抑制结直肠癌细胞增殖及皮下移植瘤的生长.
