肺穿刺诊断包虫病1例

患者男性,28岁.X线透视发现肺内有一5 cm×6 cm包块.行右肺穿刺活检术,进针时有包膜抵抗感,用力刺入有落空感,抽出无色透明清亮液体70 ml,内含多枚针尖大小灰白色颗粒状物.液体沉淀离心后,将颗粒状物石蜡包埋,切片,HE染色.镜检为细粒性棘球蚴原头节(图1,2).

3种药物体外抗细粒棘球蚴原头节作用的比较

目的通过比较氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体体外抗细粒棘球蚴原头节作用,探讨氧苯达唑抗包虫病的作用. 方法将氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体分别配成高、中、低浓度加入RPMI1640培养基中,体外培养细粒棘球蚴原头节,观察其每天的死亡率,直到对照组的头节全部死亡为止. 结果将相同条件下3种药物作用原头节的死亡率分别与对照组相比,阿苯达唑、氧苯达唑高、中、低浓度组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);而阿苯达唑脂质体仅在高浓度时与对照组的差别有统计学意义(P<0.05). 结论氧苯达唑、阿苯达唑和阿苯达唑脂质体均有显著的体外抗细粒棘球蚴原头节作用;氧苯达唑体外抗细粒棘球蚴原头节作用与阿苯达唑相当,可认为是一种新型抗包虫药;阿苯达唑脂质体剂型并未显示出特殊的体外抗原头节作用.

布洛芬抑制体外细粒棘球蚴原头节生长的实验研究

目的 探讨不同浓度布洛芬对体外细粒棘球蚴原头节生长的抑制作用. 方法 实验分为空白对照组、DM-SO组和布洛芬处理组(0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L),将体外培养的细粒棘球蚴原头节加入相应培液中孵育,经0.1％伊红染色后在倒置显微镜下观察原头节形态及活力,实验重复3次;扫描电子显微镜(SEM)下观察原头节的超微结构变化;孵育24 h后用caspase-3活性检测试剂盒检测原头节caspase-3酶活性. 结果 空白对照组和DMSO组原头节活力无明显变化.2.0 mmol/L和4.0 mmol/L布洛芬组作用48 h后原头节活力开始下降,作用12d后4.0 mmol/L布洛芬处理组无存活的原头节,2.0 mmol/L布洛芬处理组的原头节活力为26.89％,0.5 mmol/L和1.0 mmol/L组原头节活力也明显下降.SEM观察超微结构,4.0 mmol/L布洛芬组处理3d后的原头节顶突外翻、变形,吸盘变形,虫体出现虫蛀样损害.布洛芬处理组作用24 h后caspase-3酶活性分别为(18.486±0.450)、(29.045±0.273)、(36.203±0.450)、(47.537±0.450)×103活力单位,对照组为(10.016±0.358)×103活力单位,差异有统计学意义(F=3177.897,P＜0.05). 结论 布洛芬对体外细粒棘球蚴原头节有抑制作用.

ERK抑制剂PD98059对泡状棘球蚴生长的影响

目的 探讨不同浓度ERK抑制剂PD98059体外对泡状棘球蚴原头节生长的作用及形态学影响.方法 将体外培养的泡状棘球蚴分别加入6.25、12.5、25、50μmol/L PD98059中体外孵育,用0.1％伊红染色后在倒致显微镜下观察原头节形态并检测活力,试验重复3次;于透射电子显微镜(TEM)下观察PD98059作用后原头节超微结构变化;采用Caspase-3活性检测试剂盒检测原头节caspase-3酶活性.结果 DMEM/DMEM+ DMSO培养组原头节活力较开始时无明显变化.50 μmol/L PD98059作用48 h后,原头节活力下降为(55.16±0.212)％,作用第14d,无存活的原头节.低浓度组对原头节的杀伤作用较高浓度组弱.TEM观察PD98059处理后的原头节微毛及糖萼出现部分缺损,合胞体带内出现少量小的空泡,且随用药浓度的增大,空泡增大增多并出现脂滴.ELISA检测显示,经PD98059处理的原头节caspase-3酶活性较正常对照组增强.结论 ERK抑制剂PD98059在体外有抗泡状棘球蚴作用.

细粒棘球绦虫原头节可溶性抗原对树突状细胞表型分化及分泌炎症因子的影响

目的 研究细粒棘球绦虫原头节可溶性抗原(protoscolex soluble antigens,PSA)对树突状细胞(dendritic cells,DC)表型分化及分泌炎症因子的影响,探索寄生虫对宿主免疫逃避的机制. 方法 运用免疫磁珠从健康BALB/c小鼠脾脏中分选DC,分别加入PSA(10 μg/ml)、LPS(1 μg/ml)、PSA(10 μg/ml)+LPS(1μg/ml)以及等体积PBS进行刺激24 h,收集细胞及培养上清,利用流式细胞术检测DC表面活化分子的表达水平,并采用流式液相多重蛋白定量技术检测细胞因子分泌情况. 结果 PSA组DC表面表达CD40,CD80,CD86,MHCⅡ的比例为(42.33±0.59)％、(71.08±1.61)％、(73.63±5.31)％、(70.20±1.01)％,较PBS组的(29.1±8.14)％、(48.81±1.69)％、(37.37±2.57)％、(26.83.08±3.55)％均明显升高(P＜0.05),较LPS组的(61.33±4.73)％、(81.23±2.03)％、(85.40±1.57)％、(86.86±2.0l)％均显著降低(P＜0.05).PSA组培养上清中IL-6、TNF浓度为(53.67±6.23)pg/ml、(405.10±5.78) pg/ml,较PBS组的(9.44±4.06) pg/ml、(139.35±45.86) pg/ml、均显著升高(P＜0.05),较LPS组的(48.23±7.85) pg/ml、(471.40±61.07)pg/ml均显著降低(P＜0.05);且PSA+LPS组IL-6、TNF浓度为(73.42±8.00) pg/ml和(508.54±20.68),较PSA组、LPS组显著升高(P＜0.05). 结论 PSA能促进DC活化及炎症因子释放,从而诱导机体产生正向免疫应答.

胆汁对体外细粒棘球蚴原头节的作用观察

目的 探讨不同浓度的胆汁对细粒棘球蚴原头节的生长作用及形态学影响.方法 将体外培养的细粒棘球蚴原头节分别加入40％、60％、80％、100％的胆汁中体外孵育.0.1％伊红染色在倒置显微镜下检测原头节的活力及形态改变,实验重复三次;透射电子显微镜下(TEM)下观察胆汁作用后原头节表面超微结构改变.结果 不同浓度的胆汁对原头节均有杀伤作用,其中浓度为100％和80％的胆汁对细粒棘球蚴原头节杀伤作用明显.倒置显微镜下观察发现,不同浓度的胆汁作用细粒棘球蚴原头节后,原头节多呈外翻型,原头节顶突上的小钩排列紊乱,部分脱落,吸盘突起,变形,活动性减弱.随着浓度的增加,变化越明显.超微结构显示40％的胆汁作用3d后,原头节纤毛出现少量缺损,合胞体带排列较紊乱,合胞体带内出现散在少量的空泡和脂滴.60％胆汁作用3d后,合胞体带内微毛出现融合,腔内出现空泡和脂滴,数量多且大.结论 胆汁作用后,可导致体外细粒棘球蚴原头节的形态发生不同程度的改变并有有抑制作用,然而关于胆汁在体内的疗效有待于进一步研究.

汉防己甲素体外抗泡球蚴作用的研究

目的比较汉防己甲素、阿苯哒唑和汉防己甲素脂质体体外抑制原头节作用,探讨汉防己甲素抗泡型包虫病的作用. 方法将汉防己甲素、阿苯哒唑和汉防己甲素脂质体分别配制成20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml 3个浓度,并且选择低、中剂量的汉防己甲素和阿苯哒唑合用,加入RPMI1640培养基中,体外培养泡球蚴原头节,观察计数每天的死亡率,直到所有的用药组头节全部死亡. 结果汉防己甲素、阿苯哒唑低、中、高浓度组与相应的对照组比较,原头节死亡率的差异均有统计学意义(P<0.05);汉防己甲素脂质体在中、高浓度下与对照组的原头节死亡率差异有统计学意义(P<0.05);联合用药组与单药组的原头节死亡率差异亦有统计学意义(P<0.05). 结论汉防己甲素体外具有抑制泡球蚴原头节的作用,并且与阿苯哒唑联合使用时具有一定的协同作用.

去氢骆驼蓬碱抗细粒棘球蚴原头节作用研究

目的 研究去氢骆驼蓬碱在体外及小鼠体内抗细粒棘球蚴原头节的作用. 方法 通过体外药物干预试验检测去氢骆驼蓬碱(Harmine)体外杀原头蚴效果,并以去氢骆驼蓬碱对原头蚴的半数致死浓度(LC50)与传统抗包虫药物阿苯达唑(Albendazole,ABZ)相比较,评价去氢骆驼蓬碱体外抗细粒棘球蚴原头节活性;通过昆明白小鼠腹腔注射细粒棘球蚴原头节制备包虫病动物模型,观察10.0、5.0、2.5 mg/kg体重去氢骆驼蓬碱连续给药14 d对包虫病小鼠的囊湿重、抑囊率及囊泡和肝脏组织结构的影响. 结果 去氢骆驼蓬碱在体外可抑制原头蚴生长,LC50为(44.11±1.32)μg/ml;去氢骆驼蓬碱2.5、5.0、10.0 mg/kg体重均可抑制包虫病小鼠体内囊泡的生长,抑囊率分别为64.59％、68.38％和72.43％,且能破坏囊泡的生发层结构和抑制肝脏的炎症. 结论 去氢骆驼蓬碱对体内外细粒棘球原头蚴均有较强的抑制作用.

姜黄素对泡状棘球蚴原头节生长的影响

目的 观察姜黄素对泡状棘球蚴原头节生长的影响. 方法 将体外培养的泡状棘球蚴原头节分为6组:空白对照组,溶剂对照组和姜黄素20、40、60、80 μmol/L组,观测原头节活性并计算存活率;姜黄素作用原头节24 h后,应用半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)检测试剂盒检测caspase-3活性,应用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL法)试剂盒检测原头节细胞凋亡情况. 结果 培养9d后,空白对照组与溶剂对照组原头节活力无明显改变,各浓度姜黄素干预组原头节存活率与对照组相比差异均有统计学意义(F80molμmol/L=4.986,F60μmol/L=4.826,F40mol/L=4.364,F20μmol/L=3.288,P＜0.05).姜黄素对原头节的抑制作用呈时间、浓度依赖,80 μmol/L姜黄素作用9d时原头节全部死亡.不同浓度姜黄素组作用24 h原头节,caspase-3活性与对照组相比显著增高(F=446.937,P＜0.05).TUNEL法检测姜黄素干预原头节阳性率显著高于对照组(x2=7.977,P＜0.05). 结论 姜黄素对体外培养的原头节有一定杀灭作用且具有时间和浓度依赖性.姜黄素对头节的杀灭作用可能与诱导头节细胞凋亡有关,其机制尚有待进一步研究.

p38MAPK抑制剂SB202190体外抑制细粒棘球蚴原头节生长的研究

目的 探讨p38MAPK抑制剂SB202190体外对细粒棘球蚴原头节生长的作用. 方法 将体外培养的细粒棘球蚴原头节分别加入12.5、25、50、100 μmol/L的SB202190中体外孵育,在光镜下观察原头节的形态变化,同时通过伊红染色显示原头节活力.实验重复3次. 结果 孵育14d后,正常和DMSO对照组原头节的活力几乎没有改变.50 μmol/L和100μmol/L SB202190作用1d后,细粒棘球蚴原头节的活力开始下降;作用14d后,100μmol/L SB202190组无存活的头节,50 μmol/L SB202190组的头节活力仅为13.8％.12.5 μmol/L和25 μmol/L SB202190对原头节的活力也有影响,但不及高浓度组显著. 结论 p38MAPK抑制剂SB202190在体外有抗细粒棘球蚴原头节的作用.

镜检法在腹腔内接种包虫病动物模型中的应用

目的 建立一种简单快速观察腹腔内接种包虫病动物模型的方法.方法 按2000个原头节/mL剂量,用多房棘球蚴对灰仓鼠进行腹腔接种,采用肉眼观察法和显微镜镜检法在第10天,15天,18天,22天,39天和60天观察灰仓鼠腹腔内包囊、包囊液和原头节的生长情况；设空白对照组10只.结果 通过肉眼观察和显微镜镜检,发现灰仓鼠在接种后的第18天有原头蚴生长；第15天,18天和22天包囊增大、增多；第39天有成熟原头节胚基生长；第60天有不同发育程度的原头蚴.随着接种时间的延长,包囊重量与传代时间成正比.结论 本试验为制备包虫病动物模型提供了简单快速的观察方法.

细粒棘球蚴cDNA文库的构建和免疫筛选

目的 构建细粒棘球蚴原头节的λZAPⅡcDNA文库,并对构建的文库进行免疫筛选.方法 采集感染细粒棘球蚴的绵羊育囊中的原头节,用Trizol试剂抽提总RNA,用mRNA纯化试剂盒纯化mRNA作为模板合成cDNA,并对其进行末端平端化、EcoR Ⅰ接头连接和磷酸化及Xho Ⅰ酶切,然后应用Sepharose CL-2B分离柱对其进行分级分离,收集大于500 bp的cDNA片段,使用GigapackⅢGold试剂盒将合成的cDNA连接到λZAP-Ⅱ载体,并将重组载体包装到λZAP-Ⅱ噬菌体中,构建细粒棘球蚴cDNA文库.用囊型棘球蚴病患者混合血清对所构建的文库进行免疫筛选,并用NCBI中的Blast模块及其它生物信息软件对筛选出的阳性克隆进行生物信息学分析.结果 成功构建了细粒棘球蚴原头节λZAPⅡcDNA文库,文库的滴度为1.8 ×105噬菌斑形成单位(plaque forming unit,pfu)/ml,插入片段长度范围在1.0～4.0 kb间,平均插入片段长度为2.6 kb,插入效率为93.8％.对所构建的文库进行免疫筛选,共筛选到5个阳性克隆,其中有2个为细粒棘球蚴新发现基因,新发现基因存在众多B细胞表位.结论 成功构建了细粒棘球蚴原头节λZAPⅡcDNA文库,初步免疫筛选得到2个新发现基因,生物信息学分析预测它们具有潜在的诊断价值.

023细粒棘球蚴原头节胆碱脂酶的研究

细粒棘球蚴原头节β4微管蛋白的可溶性表达、纯化及生物信息学分析

目的 对细粒棘球蚴原头节的β4微管蛋白(EgTub4)基因进行生物信息学预测和分析,并探索该基因在大肠埃希菌中可溶性表达的佳诱导条件,纯化目标蛋白. 方法 采用ProtParam、SMART、Predictprotein和Swiss-model软件分析EgTub4蛋白的理化性质和结构,采用SignalP4.1软件进行信号肽预测.提取细粒棘球蚴原头节的总RNA,并反转录成cDNA,PCR扩增EgTub4基因,构建原核重组表达载体pET28a-EgTub4、pET30a-EgTub4和pET32a-EgTub4,进行酶切鉴定,并测序.探索重组蛋白rEgTub4可溶性表达的佳诱导条件[表达载体、诱导温度(T)、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间(t)和培养基类型].利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting).结果 经生物信息学分析预测EgTub4蛋白理论等电点(pl)值为4.79,理论相对分子质量(Mr)为49 700;EgTub4不含信号肽,含有3个结构域,分别为微管蛋白GTPase结构域、C末端结构域和卷曲螺旋区.成功构建了重组质粒pET28a-EgTub4、pET30a-EgTub4和pET32a-EgTub4,经双酶切后,均可得到与目的基因相对分子质量相符的片段,测序正确.经Westem blotting分析,在表达质粒pET28a(+)、pET30a(+)和pET32a(+)中重组蛋白分别为Mr56 000、60 000、68 000.EgTub4基因在pET28a(+)中表达时不可溶,主要以包涵体形式存在,需要在变性条件下进行纯化.而在pET30a(+)和pET32a(+)中表达时均部分可溶,可以在非变性条件下进行纯化.综合考虑,本研究终选择pET30a(+)作为EgTub4基因的表达载体.目标蛋白可溶性表达的优化条件为:T=25℃、[IPTG]=0.01 mmol/L、t=10h、2×YT培养液.佳洗杂咪唑浓度为150 mmol/L,洗脱咪唑浓度为500 mmol/L.Western blotting分析结果显示,纯化的蛋白均能与β-微管蛋白抗体及His-Tag标签抗体反应,条带大小符合预期,约Mr 60 000. 结论 对EgTub4进行了生物信息学预测、分析和表达,得到该基因在大肠埃希菌中可溶性表达的佳诱导条件,纯化目标蛋白.

细粒棘球蚴感染小鼠髓源抑制性细胞与Th17细胞比例的变化

目的 分析细粒棘球蚴感染小鼠体内髓源抑制性细胞(MDSCs)和Th17细胞比例的变化及意义. 方法 将20只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为感染组和对照组,每组10只.感染组每只小鼠腹腔注射细粒棘球绦虫原头节约2 000个,对照组注射等体积生理盐水.感染后8个月(感染晚期)收集感染组和对照组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞和腹腔细胞,采用流式细胞术检测小鼠MDSCs及其亚型(M-MDSCs、PMN-MDSCs)和Th17细胞比例,采用Pearson相关性分析MDSCs、M-MDSCs、PMN-MDSCs与Th17细胞比例的相关关系. 结果 感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中MDSCs比例分别为(14.72±4.27)％、(57.04±6.78)％和(15.35±5.56)％,对照组分别为(8.84±2.12)％、(30.53±1.58)％和(1.74±0.63)％,感染组与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中M-MDSCs比例分别为(1.29±0.24)％、(6.27±2.11)％、(2.14±0.94)％,对照组分别为(0.72±0.25)％、(2.11±1.27)％、(0.25±0.06)％,感染组与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中PMN-MDSCs比例分别为(9.31±2.65)％、(46.72±5.67)％、(7.06±2.36)％,对照组分别为(7.07±3.20)％、(25.42±2.05)％、(1.08±0.40)％,感染组与对照组间外周血白细胞和腹腔细胞的PMN-MDSCs比例差异有统计学意义(P＜0.05).感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中Th17细胞比例分别为(1.31±0.38)％、(1.85±0.77)％和(2.90±0.24)％,对照组分别为(0.59±0.07)％、(0.35±0.15)％和(0.41±0.12)％,感染组与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).Pearson相关性分析结果显示,感染组小鼠脾脏、外周血和腹腔细胞中MDSCs与Th17细胞比例之间无相关关系(r=-0.354、-0.746、0.801,P＞0.05),感染组小鼠脾脏M-MDSCs与Th17细胞比例呈负相关关系(r=-0.896,P＜0.05). 结论 在细粒棘球蚴感染小鼠8个月后MDSCs与Th17细胞比例均增加,感染组小鼠脾脏M-MDSCs与Th17细胞比例呈负相关关系.

他克林对多房棘球蚴抑制作用的实验研究

目的 观察他克林体外抗多房棘球蚴的作用以及抗小鼠多房棘球蚴感染的疗效. 方法 在含50～ 200个多房棘球蚴原头节的96孔板中加入浓度为100.00、50.00、25.00、12.50和6.25 μmol/L的他克林,给药后1、3、5和7d用亚甲基蓝法测定原头节的活性.同时用细胞增殖-毒性检测(CCK-8法)测定他克林对3种正常宿主细胞(L929细胞、HK-2细胞和Chang liver)以及3种肿瘤细胞(A172细胞、A2058细胞和HCT-8细胞)的细胞毒性.40只感染多房棘球蚴6个月的BALB/c小鼠随机均分为4组,分别为30 mg/kg他克林组、15 mg/kg他克林组、25 mg/kg甲苯达唑组和1％西黄芪胶对照组.各组小鼠连续灌胃给药28 d,停药14 d后处死小鼠,剖取小鼠体内多房棘球蚴囊,称取囊重并计算囊重抑制率,采用SPSS 17.0中的非参检验法进行统计学分析. 结果 他克林体外对多房棘球蚴原头节的作用呈现明显的剂量效应关系,随着药物浓度和培养天数的增加,原头节的活性显著降低.100 μmol/L的他克林作用3d后,原头节全部死亡且形态发生强烈改变,难以观察到完整的超微结构.他克林作用7d后,100.00、50.00、25.00、12.50和6.25 μ mol/L组的原头节死亡率分别为(100±0)％、(91.2±2.5)％、(80.3±5.1)％、(71.6±2.4)％和(51.7±2.9)％.他克林对正常宿主细胞活性影响较小,药物浓度增加至250.0 μmol/L,对L929细胞、HK-2细胞和Chang liver细胞的活性抑制率分别为(27.6±4.7)％、(29.6±3.9)％和(26.9±2.1)％.但是对肿瘤细胞的细胞毒性较大,A172细胞、A2058细胞和HCT-8细胞的半数抑制浓度(Tox50)分别为(178.2±3.2)、(133.2±5.2)和(128.8±4.0) μmol/L.30 mg/kg他克林组、15 mg/kg他克林组和25 mg/kg甲苯达唑组囊重抑制率分别为-3.4％、9.4％和38.2％,上述各组小鼠体内多房棘球蚴囊重的减少与1％西黄芪胶组相比均无统计学意义(P＞0.05).4组小鼠在实验周期中分别有3、6、2和5只死亡,相较于其他组,25 mg/kg甲苯达唑和15 mg/kg他克林治疗增加了感染实验鼠的生存率. 结论 他克林可直接影响体外培养的多房棘球蚴原头节的活性,可提高多房棘球蚴感染小鼠的生存率.

6个wnt基因家族基因在细粒棘球绦虫原头节和成虫的差异表达分析

目的 探讨无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族[wingless-type mouse mammary tumor virus (MMTV) integration site family,wnt]成员wnt1、wnt2、wnt4、wnt5、wnt11A和wnt11B基因在细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)原头节和成虫的mRNA差异转录及组织分布. 方法 用SYBR Green Ⅰ qRT-PCR方法检测wnt1、wnt2、wnt4、wnt5、wnt11A和wnt11B基因在细粒棘球绦虫原头节和成虫的mRNA相对转录情况.用RNA荧光探针以全量组织荧光原位杂交方法检测6个基因在原头节的组织分布情况. 结果 qRT-PCR检测结果显示,wnt1和wnt2基因mRNA在原头节和成虫的相对转录水平分别为1.00、1.49和1.00、2.53,在成虫的相对转录水平分别为原头节的1.49倍(P＞0.05)、2.53倍(P＜0.05).wnt4、wnt5、wnt1 1A和wnt11B mRNA在原头节和成虫的相对转录水平分别为1.00、0.04,1.00、0.03,1.00、0.07和1.00、0.97,在原头节的相对转录水平分别为成虫的25.00倍(P＜0.01)、33.33倍(P＜0.01)、14.29倍(P＜0.01)和1.03倍(P＞0.05),原头节和成虫间wnt4、wnt5、wnt11A表达量的差异有统计学意义,而wnt11B的差异则无统计学意义.全量组织荧光原位杂交结果显示,在原头节中,wnt1主要分布于表皮组织,wnt2主要分布于吸盘部位,wnt4主要分布于吸盘和顶突部位,wnt5、wnt11B主要分布于吸盘和表皮,wnt11A主要分布于顶突和小刺. 结论 wnt2基因在细粒棘球绦虫成虫的mRNA相对转录水平高于原头节,wnt4、wnt5、wnt11A在原头节的mRNA相对转录水平高于成虫,6个wnt基因均分布于细粒棘球绦虫原头节的前端区域.

细粒棘球蚴感染小鼠腹腔巨噬细胞表型及吞噬功能的变化

目的 研究细粒棘球蚴感染小鼠腹腔巨噬细胞(Mψ)的表型及吞噬功能变化,探索Mψ在宿主应答寄生虫感染中的作用. 方法 将24只6～8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为对照组和感染组,每组12只.感染组每只小鼠腹腔注射2 000个原头节.对照组注射等体积PBS.于感染后5个月,收集对照组和感染组小鼠腹腔单核细胞,采用流式细胞术检测Mψ比例及其表面分子CD40、CD80、CD86、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)的表达情况;采用中性红吞噬实验检测Mψ密度为1×106、5×105、1×105时的吸光度(A490值),评价其吞噬能力. 结果 对照组和感染组Mψ占单核细胞的比例分别为(20.75±5.91)％和(30.40±3.15)％,感染组高于对照组(P＜0.05).感染组Mψ表面表达CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的比例分别为(45.33±5.51)％、(61.00±10.61)％、(56.88±10.66)％和(27.00±3.82)％,较对照组的(41.43±6.19)％、(59.23±8.65)％、(10.91±1.82)％和(13.67±3.01)％均明显升高(P＜0.05).感染组Mψ密度为1×106、5×105、1×105时的A490值分别为0.41±0.03、0.24±0.05和0.16±0.01,低于对照组的0.61±0.15、0.47±0.07和0.18±0.01,差异均有统计学意义(P＜0.01). 结论 感染致小鼠腹腔Mψ吞噬能力下降,但其活化相关表面分子表达上调.

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-01883的克隆、表达及免疫原性分析

目的 筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据. 方法 分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883.提取细粒棘球蚴原头节总RNA,用RT-PCR对目的基因Eg-01883进行克隆,重组构建原核表达载体pET28a-Eg-01883,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的重组蛋白rEg-01883.ICR小鼠随机分为3组(每组12只),免疫组小鼠的背部皮下多点注射rEg-01883,2周后加强免疫1次(剂量均为10 μg,100 μl/只);佐剂组注射福氏佐剂和PBS,空白对照组不作任何处理.分别于免疫前,首次免疫后1、2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后6周进行去眼球采血.用ELISA检测3组小鼠免疫后不同时间点的血清特异性IgG抗体水平,及细胞因子白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平.蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白rEg-01883的免疫原性. 结果 筛选出在细粒棘球蚴原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达和纯化后获得重组蛋白rEg-01883,该蛋白主要以包涵体形式存在.ELISA检测结果显示,用纯化后的重组蛋白rEg-01883免疫小鼠,可诱导产生特异性IgG抗体,免疫组小鼠的血清IgG抗体水平自首次免疫后1周开始上升,6周时达到高水平(2.344±0.153),显著高于佐剂组(0.206 1 ±0.006)和空白对照组(0.241±0.01) (P＜0.01).首次免疫后6周,血清中的细胞因子IFN-γ和IL-4水平,免疫组分别为43.23 pg/ml和24.88 pg/ml,均显著高于佐剂组(21.77 pg/ml,13.27 pg/ml)和空白对照组(17.40 pg/ml,12.25 pg/ml) (P＜0.05).Western blotting分析结果显示,该重组蛋白rEg-01883抗原可被His-Tag标签抗体、免疫组小鼠血清、原头节继发感染的小鼠血清识别. 结论 筛选获得细粒棘球绦虫原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达、纯化后的重组蛋白rEg-01883免疫ICR小鼠具有较好的免疫原性.

氨基醇咔唑化合物BTB3体外抗细粒棘球蚴效果的评价

目的 观察氨基醇咔唑化合物BTB3体外抗细粒棘球蚴的效果. 方法 体外培养羊源细粒棘球蚴原头节和继发感染小鼠来源的生发层细胞,用浓度为1、2、4、8、10和20-μg/ml的BTB3作用3d后,分别采用美兰染色法和CCK-8法检测原头节和生发层细胞的活性.用扫描电镜观察10μg/ml BTB3对生发层细胞造成的损伤.体外培养细粒棘球蚴囊,用浓度为1、5和10 μg/ml的BTB3作用2周后,观察其对囊的影响,并用扫描电镜观察囊内部结构的变化. 结果 10μg/ml和20 μg/ml BTB3组原头节的死亡率分别为(100.0±0.0)％和(85.2±7.2)％.但当浓度降低后,原头节死亡率均低于10％.生发层细胞经8、10和20 μg/ml BTB3作用后,其细胞活性抑制率均达100％,其余低浓度BTB3组的抑制率随浓度的降低而降低.扫描电镜观察发现,BTB3可使生发层细胞发生脱落、皱缩以及空腔化.10μg/ml BTB3作用于棘球蚴囊14 d后,全部囊均出现塌陷.其超微结构显示,BTB3作用后棘球蚴内囊中出现了细胞脱落和不均匀的现象. 结论 BTB3对体外培养的细粒棘球蚴原头节、生发层细胞和棘球蚴囊均有较强的作用,是一种潜在的抗棘球蚴药物.