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日本血吸虫未知基因的原核表达载体的构建和表达分析
目的构建日本血吸虫未知基因的原核表达载体,研究基因性质. 方法首先将从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选得到的未知基因cDNA JAYL0230亚克隆入原核表达载体pET28a(+)中,IPTG诱导重组蛋白的表达,免疫印记实验检测其免疫性质. 结果成功构建重组原核表达载体pET28a(+)-JAYL0230,并获得稳定表达的融合蛋白,免疫印记实验证明该融合蛋白具有免疫反应性. 结论本实验为进一步深入研究该基因的性质及功能提供了基础.
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冠心病相关基因的全基因组扫描策略与研究进展
冠心病是严重危害人类健康,并受多种遗传、环境因素及其之间相互作用影响的复杂性疾病.因此,深入进行遗传和环境因素研究,将为预防和控制冠心病提供依据.全基因组扫描新策略对于筛查多基因疾病的致病和易感基因无疑具有里程碑式的意义,其对疾病相关基因的定位,不再依赖已知候选基因,并可在整个基因组范围内对未知基因进行筛查[1].在过去的2年里,已从40种常见疾病中鉴定出100多个新致病基因位点[2],使人类深入认识了基因与基因、基因与疾病之间的遗传学关系.现对全基因组扫描策略在冠心病相关基因定位中的应用与研究进展综述如下.
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应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBV CSTP1反式激活相关基因.方法:以HBV CSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取25个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得23个已知基因序列和2个未知基因.未知基因的功能还正在研究中.结论:应用SSH技术成功构建了HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBV CSTP1反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.
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乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1的基因克隆化研究
目的:发现了与乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ(HBVSP Ⅰ)结合的未知功能蛋白,并克隆了他的全长基因.方法:以SP Ⅰ核心序列为"诱饵",应用酵母单杂交技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,得到了一个未知基因,命名为乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1(SBP1).结合生物信息学技术,应用分子生物学技术,克隆了SBP 1的基因编码序列.结果:经酶切和测序鉴定,结果正确,成功克隆了SBP 1的基因编码序列.结论:SBP 1具有完整的开放读码框,可能通过与SP Ⅰ的结合发挥生物学作用.
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乙型肝炎病毒前-S2蛋白结合蛋白基因S2-29的克隆化研究
目的:筛选人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白(Pre-S2)相互作用的蛋白,探寻HBV致病机制.方法:用多聚酶链反应(PCR)技术扩增HBV前-S2基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,用营养缺陷型培养基及蓝白斑双重筛选阳性菌落,提取酵母质粒转化大肠杆菌并测序,进行生物信息学分析.逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法从HepG2细胞的mRNA中扩增出完整的新基因S2-29,连入另一酵母表达载体pGADT7,并用免疫共沉淀方法再次证实二者间的相互作用.结果:成功克隆出HBV前-S2基因并在酵母细胞中表达,配合后筛选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落26个,其中有1个未知基因S2-29,该基因能在HepG2细胞中表达,免疫共沉淀方法证实二者在体外也有结合作用.结论:成功克隆出与乙型肝炎病毒前-S2蛋白相结合的新基因,为进一步研究HBV前-S2的作用提供了新线索.
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AD患者α2-巨球蛋白基因:群体研究和荟萃分析
许多理由认为α2-巨球蛋白基因(A2M)是阿尔茨海默病(AD)的候选基因。首先,它是丰富的血清胰蛋白酶抑制剂,且像apoE一样,是脂蛋白相关受体蛋白的主要配体;其次,A2M蛋白参与在AD老年斑中聚集的β-淀粉样蛋白的结合、降解、清除作用。近来许多研究报道A2M与晚发性AD(LOAD)相关,但其它一些研究却不能重复这一现象。为评估A2M在AD中的作用,该文作者采用群体前瞻性研究和荟萃分析方法,分析EOAD患者100人,平均年龄57岁,23%是男性,对照组116人,平均年龄61岁,45%男性;LOAD患者344人,平均年龄82岁,20%男性;对照组242人,平均年龄81岁,40%男性。分析与apoEε4有关的A2M-I/D和A2M-Ile1000Val两种多态性,统计分析采用χ2检验,分析其等位基因频率和连锁不平衡。结果显示在LOAD和EOAD患者未发现与A2M-I/D和A2M-Ile1000Val任何一种基因型或等位基因有关,虽然A2M-DD基因型频率在EOAD患者升高(4%),但与对照组相比(1%)不明显。在apoEε4等位基因携带者,A2M-D或A2M-1000Val的基因型频率与对照组相比无显著性差异;非携带apoEε4的EOAD患者,A2M-1000Val携带者明显增高(P<0.04)。在家族性、常染色体遗传和散发性EOAD可发现相似的A2M-I/D频率明显降低;在白种人和混合人种病例对照多态性研究发现,两组无显著性差异。结果提示A2M与白种人和混合人种LOAD的遗传性无关,在这些人群中A2M没有临床相关性。作者认为,亚洲人群AD患者的A2M-D频率降低可能是由于在第12号染色体上A2M-D等位基因与其附近的某个未知基因紧密连锁,该未知基因与AD有关,而A2M基因本身并不直接导致AD。从科学的角度来说,对EOAD和亚洲A2M的研究结果尚需要重复及进一步探索。(王 磊摘 叶 玲校)
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幽门螺杆菌感染治疗的新靶位
抗生素治疗幽门螺杆菌感染面临着细菌耐药性的威胁,研究该细菌未知基因的功能,寻找新的抗菌靶,将为预防和治疗幽门螺杆菌感染开辟新途径。将机体适应性免疫应答运用于幽门螺杆菌感染的治疗,亦有广阔前景。
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广州管圆线虫Ⅳ期幼虫cDNA文库的筛选及EST序列分析
目的 筛选和鉴定广州管圆线虫未知基因序列,丰富该虫的基因序列数据,为寻找诊断或药物靶点分子提供实验依据.方法 构建广州管圆线虫Ⅳ期幼虫cDNA噬菌体文库,随机挑选单个噬菌斑,提取噬菌体DNA进行PCR,扩增其插入的cDNA片段并对PCR产物进行序列测定;采用生物信息学方法对表达序列标签(expressed sequence tags,EST)序列进行分析.结果 获得了51条广州管圆线虫基因的EST序列,并提交至GenBank,这些基因包括半乳糖凝集素10,半乳糖凝集素140,表皮蛋白,CRE-RPS-24蛋白等.序列分析结果提示,表皮蛋白和CRE-RPS-24蛋白可能为具有诊断价值的抗原分子,值得进一步研究.结论 获得51条广州管圆线虫基因序列,为进一步研究广州管圆线虫致病机制及候选抗原分子提供了新的序列信息.
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冲击波促进骨肌系统损伤修复的机制研究进展
自第二次世界大战首次发现深水中炸弹爆炸能对肺组织产生严重损伤以来,人们对冲击波的研究兴趣始终不减,认识也愈加深刻,其应用也更为广泛.在欧洲,体外冲击波(Extracorporeal Shock Wave,ESW)治疗骨肌系统疾患的例数已经超过碎石患者;冲击波还能将核甘酸等大分子物质导入细胞浆及细胞核;根据这一特性,人们尝试利用冲击波分析未知基因和治疗肿瘤.
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5′-RACE技术在钓取未知基因中的应用
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应用于精准医学研究的转录组可变剪接分析
精准医学是针对患者的基因组(转录组、表观组等)和个体特点进行防治的未来医学模式。随着人类基因组计划的完成,针对复杂疾病的第三次医药卫生革命—“精准医学”拉开了序幕。近15年来,通过对组学数据与各种临床表型相关性的不断深入解析,人类已经对复杂疾病有了相当深入的认识;同时,千美元基因组测序的实现,使得规模化开展精准医学研究成为可能。RNA-Seq是一种研究转录组的强大工具,在精准医学的研究中有重要作用。它使用第二代测序技术,能够快速获得某个物种或组织在特定条件下所表达的全部转录本序列,相当于一种对RNA的存在和数量的快照技术[1],可用于研究未知基因、剪接异构体等微阵列技术所无法研究的内容。通过将具有足够深度的RNA-Seq数据与整个基因组或转录组进行比对,笔者可以更为精确地从整体水平研究基因功能及基因结构、分析基因的表达水平、鉴定新的转录本、检测融合基因或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs),以及识别可变剪接等[2]。随着第二代测序技术的广泛应用,得到的测序数据正以惊人的速度扩增,现在每次测序已经可以产生150bp或更长的读段(reads),而且每次运行的通量已达到TB级。高通量测序技术的发展为精准医学的研究带来了前所未有的机遇,但数据的爆发式增长也为后续的分析带来了巨大的挑战。现简要介绍从RNA-Seq数据中鉴定可变剪接,以及后续的差异比较等方面的精准医学领域研究进展。