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粉尘颗粒诱导大鼠肺泡巨噬细胞培养条件的优化
目的 利用极差分析法和正交实验探究外周血分离白细胞的佳条件.方法 利用不同的转速、时间分别分离外周血液中的白细胞,将所得的细胞重悬液转移到培养皿中,在荧光倒置显微镜下计数细胞个数,再采用正交实验和极差分析法对实验数据进行分析.结果 通过极差分析法发现,血量的极差大,时间的极差小,所以对分离白细胞主要的影响因子为血量,小的K值反映了适宜的配比,该配比离心转速为1000 rpm、时间为20 min、血量为5 mL.结论 外周血分离白细胞的佳条件为离心转速1000 rpm、时间20 min、血量5 mL.
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自然种群淡色库蚊钠通道基因全长的克隆及序列分析
本研究采用反转录多聚酶链式反应（ RT-PCR）的方法对野外采集的河北种群淡色库蚊的钠离子通道基因进行了克隆和序列分析。得到的克隆序列与GenBank中公布的序列能够吻合，说明成功克隆出淡色库蚊的钠通道基因全长，为抗性突变的研究奠定了基础。本研究在淡色库蚊钠通道基因上发现了多处氨基酸突变（A32T、 T336A、 S342P、 K535E、 L1035F、 N1595S和F1982L）和7处可变剪接。其中，包括经典的抗性突变L1014F （ L1035F）。但这些突变和可变剪接与蚊虫抗性的关系有待进一步研究。
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淡色库蚊乙酰胆碱酯酶基因上的可变剪接及对酶活性的影响
在淡色库蚊的乙酰胆碱酯酶ace1基因上发现了1个可变剪接,与实验室敏感株1个个体的ace1基因的编码区相差了24个碱基,导致所编码的成熟蛋白在44～51氨基酸残基处缺失了8个氨基酸.经过在昆虫杆状病毒表达系统中的表达,推测这段基因的可变剪接可影响乙酰胆碱酯酶的活性.
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低氧性肺动脉高压小鼠肺的环状RNA表达谱研究
目的 采用环状RNA (circRNA)芯片筛选低氧性肺动脉高压(HPH)小鼠肺组织中差异表达的circRNA,分析circRNA表达谱特征,为HPH发生机制提供研究方法.方法 20只健康雄性C57BL/6小鼠(体质量17 ～ 20 g)按数字表法随机分为HPH模型组与常氧组,每组10只.HPH模型组小鼠置于自制常压低氧舱内,舱内氧浓度(10±0.5)％02.每天连续低氧处理8h,连续21d.常氧组小鼠置于常氧环境饲养.通过测定右心室收缩压和右心肥大指数验证HPH小鼠模型复制成功后,处死小鼠,取肺组织,用circRNA芯片检测各组肺组织circRNA表达谱,并进行组间比较与分析,以明确差异表达的circRNAs.结果 与常氧组比较,HPH模型组肺组织中表达显著上调的circRNAs共有23个(P ＜0.01,P ＜0.05);表达显著下调的circRNAs共有41个(P＜0.01,P＜0.05).结论 circRNA芯片可用于筛选HPH差异表达的circRNA,circRNA可能参与HPH调控机制.
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环状RNA的研究现状及展望
环状RNA(circular RNA,circRNA)或称环形RNA,是新近确认的一类特殊的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)分子,是继microRNA (miRNA)后RNA家族的一颗极具发展潜力的正在升起的新星,也是RNA领域新的研究热点,方兴未艾.通过与疾病关联的miRNA相互作用,circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用,有巨大潜力成为新型的临床诊断标志物.
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乳腺癌中c-MYC调节的剪接基因鉴定及其临床意义分析
目的 鉴定c-MYC调节的剪接相关基因,分析其基因组水平的改变,并评价其潜在的预后价值.方法 采用癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库分析乳腺癌中与c-MYC共表达的基因;功能富集分析剪接相关基因;采用String蛋白数据库绘制剪接基因互作网络图;采用TCGA数据库分析剪接基因在基因组水平的改变,包括突变、扩增和缺失等,对比淋巴瘤剪接基因研究确定候选基因;采用Kaplan-Meier plotter数据库分析候选基因与乳腺癌患者生存的关系.结果 乳腺癌中与c-MYC共表达的基因中剪接基因共有16个,主要为剪接体复合物、U12-型剪接体复合物和剪接体snSNP复合物.这16个剪接基因在乳腺癌中均有不同比例的拷贝数扩增.本研究分析的乳腺癌数据中与c-MYC共表达的基因与已知的淋巴瘤中的基因存在多个重叠基因,即WDR77、GEMIN4和SNRPD1,这3个基因的表达与乳腺癌患者的总生存期和无复发生存期均有关.结论 在乳腺癌中鉴定了16个c-MYC调节的剪接基因,这些基因在乳腺癌中大多存在拷贝数扩增,其中WDR77、GEM-IN4和SNRPD1可作为乳腺癌预后的标志分子.
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环状RNA与肿瘤研究进展
目的 环状RNA(circular RNA,circRNA)是一大类共价结合形成环形结构的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),在生物体内对基因表达具有重要的调控作用.本文拟对环状RNA的生物来源、特征、生物学功能,及其在肿瘤中的研究进展进行综述.方法 应用PubMed和CNKI期刊全文数据库检索系统,以“环状RNA(circRNA)、可变剪切(alternative splicing)、生物来源(biogenesis)、生物功能(biological functions)和肿瘤(cancer/carcinoma)”等为关键词,检索1976-01-01-2016-12-10的相关文献.纳入标准:(1)环状RNA的生物来源、特征、生物学功能;(2)环状RNA与肿瘤之间的关系.剔除标准:(1)阐述机制模糊;(2)实验设计不严谨.符合纳入标准的文献127篇,根据剔除标准剔除文献66篇,后纳入分析文献61篇.结果 环状RNA作为RNA家族中一类特殊的内源性非编码RNA,如今已经提出了多种产生环状RNA的机制,环状RNA的形成受ALU元件的反向重复序列、外显子跳跃、RNA结合蛋白和其他因素的影响.由于环状RNA具有高度保守、稳定、在细胞质中丰度高等特征,随着研究的深入,发现其具有作为miRNA海绵、可变剪接调节器、转录因子和编码蛋白等作用.环状RNA可以调节大量肿瘤相关的miRNAs表达,环状RNA-miRNA-mRNA轴参与多个肿瘤相关通路的调节,包括促瘤作用和抑瘤作用.结论 环状RNA有多种生成机制,且受多因素影响,由于其稳定、保守、表达量大等特点,发现其有多种生物学功能,且与肿瘤的发生发展有重要的关联,环状RNA很有希望成为肿瘤诊断的新标志物和肿瘤治疗的新分子靶点.
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RNA结合蛋白多聚嘧啶通道结合蛋白1在肿瘤中的研究进展
多聚嘧啶通道结合蛋白1(PTBP1)是调控可变剪接及mRNA代谢过程中的重要蛋白.它的异常表达可造成其下游靶基冈的可变剪接及mRNA水平的改变,直接参与肿瘤的发生、发展.PTBP1是具有很大潜力的肿瘤标志蛋白.
关键词： 肿瘤 多聚嘧啶通道结合蛋白1 可变剪接 -
纤维粘连蛋白在口腔肿瘤组织中的表达
纤维粘连蛋白是一种多功能的糖蛋白,在细胞外基质中广泛分布.体内仅有单一的FN基因,可在ED-A、ED-B和ⅢCS三个位点上发生可变剪接,形成不同的成熟mRNA,产生多种形式的多肽.纤维粘连蛋白对口腔肿瘤细胞的形态变化、粘附、迁移、增殖和分化,以及免疫细胞的功能均有一定作用.对纤维粘连蛋白及其mRNA可变剪切片断的结构、表达、功能、调节的深入研究,将为口腔肿瘤的预防、诊断和治疗提供一定的理论依据.
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急性和慢性髓性白血病细胞中可变剪接事件的识别
目的：为揭示异常的可变剪接在肿瘤中发挥的作用，着重研究急性髓性白血病（ AML）与慢性髓性白血病（CML）内显著差异的可变剪接事件以及剪接异构体。方法基于CML（K562）和AML（THP1、HL－60）细胞系的全转录组测序数据，在全基因组范围内采用TopHat、MATS和Cufflinks计算识别可变剪接事件、重构剪接异构体和分析其差异表达。结果在AML和CML细胞间识别的130个基因在CML细胞系中特异性高表达，80个基因在AML两株细胞系内均表达上调。在CML与AML之间识别了337个差异表达的剪接异构体以及35个差异可变剪接事件。结论 AML与CML细胞系间存在显著差异的可变剪接事件和剪接异构体。白血病相关的可变剪接事件可作为其潜在的标志物或药物靶标。
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小鼠sidt2基因的可变剪接验证
目的:验证小鼠基因sidt2中sidt2(l)和sidt2(s)为同一基因经可变剪接所得的结果.方法:对小鼠sidt2基因进行生物信息学分析及基因组PCR,确定其基因组定位情况;通过提取总RNA、RT-PCR,了解sidt2在小鼠多种组织中的表达情况;构建可变剪接报告载体,转染小鼠肝癌细胞Hepa1-6,并提取细胞总RNA、RT-PCR,检测其在细胞中的剪接行为,验证该基因存在可变剪接. 结果及结论:证实小鼠sidt2存在可变剪接,其两条序列sidt2(l)和sidt2(s)为可变剪接的产物.
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神经系统特异性剪接因子NOVA研究进展
神经-肿瘤腹侧抗原(NOVA)是第一个在哺乳动物中发现的组织特异性剪接因子,广泛分布于中枢神经系统,通过其KH结构域(KH domain)与靶基因mRNA前体中的YCAY基序(YCAY motif)结合,调控可变剪接过程.根据其与靶标结合位置的不同,NOVA作为剪接调节因子具有双重作用,既可以增强剪接,也可以抑制剪接.NOVA作为剪接因子特异性地调控了神经突触中一组功能密切相关的基因.
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外显子芯片的数据分析和可变剪接预测的新算法
可变剪接(alternative splicing)是产生高等真核生物蛋白质多样性的重要分子调控机制之一,众多研究表明,可变剪接可以改变蛋白质的结构和功能从而导致多种人类疾病.外显子芯片是Affymetrix公司开发的全基因组范围内检测外显子表达的高通量芯片系统,可通过检测外显子的差异表达来推断可变剪接事件.和传统的3′基因表达芯片相比,外显子芯片不仅探针(probe)设计的密度大,而且覆盖了全转录本中所有已知和预测的外显子.外显子芯片的数据分析包含基因和外显子两个水平的分析流程以及可变剪接预测部分.由于使用常规的芯片分析方法并不能有效地预测可变剪接事件,因此本文就现有的外显子芯片分析方法和流程进行综述,并着重介绍可变剪接事件预测的新算法.
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VEGF基因可变剪接在根尖周囊肿骨破坏过程中的作用
目的 本研究以根尖周囊肿为疾病模型,根据其临床特点确定骨破坏速率,并利用免疫组织化学方法观察间质中微血管密度;同时原代培养囊壁成纤维细胞,检测其中各种VEGF异构体对微血管增生及破骨细胞诱导效率的影响,探讨VEGF可变剪接在牙源性囊肿骨破坏过程中的作用.方法 选取19例根尖周囊肿,以CD34抗体免疫组化染色凸显血管内皮细胞,并计算血管腔面积,曲面断层影像进行病变面积的测量,并选取其中13例新鲜手术标本进行根尖周囊肿囊壁成纤维细胞培养,制备条件培养基和诱导破骨细胞,并进行RNA的提取及realtimePCR检测VEGF异构体的相对表达量.x2检验用于评估CD34阳性的血管腔面积和临床特点.血管腔面积、各种异构体相对表达量、囊肿进展速率和破骨细胞诱导效率的关系由线性回归及Spearman's等级相关评估.结果 VEGF-121a/总VEGF和VEGF-165a/总VEGF正相关于微血管管腔面积,后者则与囊肿骨破坏速率正相关;而VEGF和VEGF-189a的相对表达量正相关于破骨细胞诱导效率,VEGF-165b/总VEGF和VEGF-189b/总VEGF则与破骨细胞诱导效率成负相关.结论 提示VEGF-xxxa型可能主要促进囊肿的骨坏过程,而VEGF-xxxb型则可能有抑制效果.
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Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响
目的 通过分析Fkbp51基因敲除(knock out,KO)与野生型(wild type,WT)小鼠肝脏表达谱,研究Fkbp51基因敲除对肝脏组织基因可变剪接的影响.方法 利用二代测序对Fkbp51 KO与WT小鼠肝脏进行表达谱测序,用TopHat对RNA测序结果进行可变剪接分析,筛选出KO与WT小鼠肝组织中差异的内含子保留(intron retetion,RI)和外显子跳跃(exon skipping,SE).通过在线工具DAVID对这些差异可变剪接体进行基因功能 (gene ontology, GO)和代谢通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,同时用NCBI 基因数据库对这些基因进行注释.结果 (1)Fkbp51缺失可导致小鼠肝脏mRNA可变剪接发生变化;(2)Fkbp51基因敲除造成小鼠肝脏mRNA可变剪接表达量的变化;(3)通过GO与KEGG分析,我们发现这些发生差异可变剪切的基因主要与脂肪相关衍生物的代谢、免疫、胆汁酸分泌等通路相关.(4)与差异内含子保留相关的基因主要与肌动蛋白细胞骨架调控,氨基酸及其衍生物代谢相关.结论 Fkbp51基因敲除能够改变基因组中mRNA的可变剪切,进而影响小鼠肝脏的代谢功能.
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DNA修复基因可变剪接及非编码RNA调控网络作为恶性肿瘤发生及预后生物学标志的意义
环境致癌因子攻击DNA等生物大分子造成DNA原始损伤,成为细胞癌变的起始动力.但机体存在的DNA损伤修复系统对于维持基因组的稳定性具有重要意义.DNA修复基因作为首类环境应答基因,其遗传多态性一直是恶性肿瘤易感及预后生物标志研究的热点.然而近年来研究发现基于碱基序列改变的单核昔酸多态性及单体型显然不足以全面反映转录组和蛋白质组多态性,而表观遗传学RNA调控领域的研究进展却拓宽了相应的研究思路.DNA修复基因可变剪接及非编码RNA调控网络作为恶性肿瘤发生及预后生物学标志的研究及意义备受关注.本研究对体现蛋白质多样性及疾病表达复杂性的可变剪接及包括microRNA、lncRNA、circRNA在内的非编码RNA调控网络调控DNA修复基因的作用及其在环境致癌因子所致恶性肿瘤发生发展中的生物学意义进行简要综述.
关键词： DNA修复基因 环境致癌因子 遗传多态性 可变剪接 非编码RNA调控网络 -
Tau蛋白与Alzheimer病
1 Tau的分子生物学Tau蛋白由17号染色体长臂上的单基因编码,经可变剪接产生6种同型.成人脑可表达tau的6种异构 ,分别由352～441个不等的氨基酸构成,tau羧基末端可见1个重复片段,内含3～4个相同的氨基酸重复序列,每个序列由31～32个氨基酸残基组成.氨基末端含有1个29～58个氨基酸残基的插入序列,CSFtau蛋白形成不同的异构体.外周神经系统主要表达较大的tau异构体,其氨基末端插入254个氨基酸.Tau的表达受发育调控,胎脑仅表达序列短的tau异构体,内含3个重复序列,无氨基末端插入,磷酸化水平高于成人tau[1-2].Tau mRNA主要在神经元和少突胶质细胞表达.tau主要见于轴突,促进微管装配,与微管结合,维持微管稳定.tau的重复区域与其侧面相接顺序,为微管结合位点.Tau不是必需蛋白,同种重组灭活tau基因,可见小管径微管的数目减少,但并无明显表型[3].
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Myc/his-TDP-43融合蛋白对tau外显子10可变剪接的影响
目的:构建带myc/his标签的pcDNA3.1/TDP-43及其截断体质粒,探讨myc/his-TDP-43融合蛋白对tau外显子10可变剪接的影响.方法:采用PCR法扩增TDP-43基因及其各截断体,将扩增产物和载体pcDNA3.1双酶切后回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒.在HEK-293FT细胞中转染pcDNA3.1/TDP-43·myc·his及其截断体质粒,Western印迹法检测相关蛋白的表达.TDP-43或siTDP-43和tau迷你基因SI9/SILO共转,RT-PCR检测TDP-43对tau外显子10可变剪接的影响.结果:成功构建了pcDNA3.1/TDP-43·myc·his全长及各截断体质粒,并在HEK-293FT细胞中检测到其蛋白表达.Myc/his-TDP-43融合蛋白可呈剂量依赖性促进4R-tau的表达(P＜0.05或0.01).结论:Myc/his-TDP-43融合蛋白可促进4R-tau的表达,携带myc/his标签不影响TDP-43对tau外显子10可变剪接的促进作用,为后续研究奠定了基础.
关键词： 反式激活反应DNA结合蛋白 Tau蛋白 可变剪接 阿尔茨海默病 -
肌钙蛋白T迷你基因的构建及其心衰模型表达谱系研究
目的：研究肌钙蛋白T(cardiac troponin T, cTnT)基因外显子5(exon 5, E5)的可变剪接及其在真核细胞和小鼠心力衰竭(心衰)模型的表达情况。方法：通过分段PCR构建包含cTnT外显子2~6及相应的内含子的基因片段，连接至真核表达载体中，转染真核细胞HEK293FT，观察其在细胞的表达和在体心肌中的表达是否有异同；建立小鼠心衰模型，用免疫组织化学法和PCR研究cTnT E5的表达情况。结果：cTnT迷你基因在HEK293FT细胞内表达出3个剪接异构体，分别是1个cTnT E5+和2个cTnT E5-；小鼠心脏内主要表达3个剪接异构体，组成情况和迷你基因表达产物相似；小鼠心衰模型组的cTnT E5+比例增高。结论：成功构建cTnT迷你基因，可用于进一步研究cTnT E5的可变剪接表达调控；小鼠心衰模型显示cTnT E5的表达和心肌功能有一定联系。
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NCAM L1小基因模型的建立及其剪接模式研究
目的:建立可用于前体mRNA可变剪接分析的NCAM L1小基因模型.方法:以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得NCAM L1小基因片段,并将其克隆至真核表达载体中,构建小基因的质粒.在此基础上,用NCAM L1小基因模型转染HeLa、COS-1、PFSK及R28细胞,并用RT-PCR进行被剪接的小基因产物的半定量检测.结果:NCAM L1小基因在4种细胞中的剪接模式不同,在PFSK以及Hela细胞中,存在2种剪接亚型,而在COS-1以及R28细胞中只有一种剪接亚型存在.结论:所构建的NCAM L1小基因可用于细胞水平的基因剪接分析.
