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北京地区人冠状病毒NL63 N和E蛋白基因序列及生物信息学分析
为了解北京地区新近发现的新型冠状病毒-人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63,HCoV-NL63)的N和E蛋白编码基因的特征,从经RT-PCR检测阳性的临床标本中扩增得到的HCoV-NL63 N蛋白和E蛋白编码基因序列,分别克隆至pCF-T和pUCm-T载体中并进行测序,同时运用生物信息学的方法,对北京HCoV-NL63阳性标本BJ8081 N和E蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列与HCoV-NL63原型株及其他几种冠状病毒的N和E蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列进行比较分析和种系进化分析;用SOPMA方法对BJ8081 N和E蛋白的二级结构进行了预测分析,并对N和E蛋白的其他生物学特性进行了预测分析.经序列比对分析发现,BJ8081 N蛋白氨基酸序列在78～85肽段(FYYLGTGP)内与所比较的其他冠状病毒N蛋白相应位置的氨基酸序列完全相同,提示此区段可能为包括HCoV-NL63在内的所有冠状病毒N蛋白的保守区域.在BJ8081 N蛋白氨基酸序列的100～121肽段可能是和基因组RNA相结合的位置;在BJ8081 E蛋白的15～37位氨基酸可能是E蛋白的跨膜区域.研究对BJ8081 N蛋白和E蛋白的编码基因序列进行了测定和生物信息学分析,为今后对HCoV-NL63的进一步深入研究奠定了基础.
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登革病毒4型E蛋白的表达与多克隆抗体的制备
目的 在原核细胞中表达登革病毒4型E蛋白及E蛋白Ⅲ区,分别以两种蛋白免疫家兔,获得可检测登革病毒的多克隆抗体.方法 将登革病毒4型E蛋白与E蛋白Ⅲ区编码序列克隆到pET-32a(+)质粒中,分别构建两种蛋白的表达载体,以IPTG诱导其在Rosetta细胞中的大量表达,并进行SDS-PAGE检测.分别以两种蛋白免疫家兔,制备出针对E蛋白与E蛋白Ⅲ区的多克隆抗体,并对其进行Western blot鉴定.结果 登革病毒4型E蛋白与E蛋白Ⅲ区在Rosetta细胞中以包涵体的形式大量表达；利用所制备的多克隆抗体对登革病毒进行检测,出现了预期的条带.结论 本研究制备获得的多克隆抗体可用于登革病毒的检测,为登革病毒相关研究奠定了基础.
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登革2型病毒E蛋白基因的酵母表达
为研究登革病毒与蚊虫相互作用的分子机制,本研究对DENV-2的E蛋白基因进行了毕赤酵母分泌表达.首先,经RT-PCR方法克隆DENV-2的E蛋白基因,将克隆的基因与表达载体pPICZaB连接以构建表达重组子;并经酶切、PCR、测序筛选实验鉴定正确重组子.然后,重组子经氯化锂法转化毕赤酵母菌KM71H获得转化子;经抗生素、表型鉴定、PCR筛选得到Muts型的多拷贝转化子.后,经甲醇诱导基因表达,Western-blotting方法鉴定蛋白表达情况及佳表达时间.本研究对DENV-2的E蛋白成功进行了分泌表达,并且确定其表达佳发酵时间为96 h;为进一步研究登革病毒与蚊虫相互作用的分子机制奠定了基础.
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一株抗JEV单抗可变区的计算机建模及其与JEV E蛋白的分子对接
目的 利用计算机建模获得单克隆抗体2F2可变区三维结构,再与日本脑炎病毒(JEV)E蛋白进行模拟分子对接,了解JEV E蛋白上与2F2作用的关键氨基酸位点,为阐明2F2的中和作用机制奠定基础.方法 利用BLASTP软件在蛋白质数据库(PDB)中搜索2F2同源蛋白.以同源蛋白为模板,用Modeller软件对2F2可变区主链、侧链进行建模,组装出完整的2F2可变区三维结构模型并进行一系列分子动力学优化,得到能量低的单抗可变区三维结构.后利用Discovery Studio软件模拟2F2可变区与JEV E蛋白的分子对接.结果 获得2F2可变区三维结构模型.模拟分子对接结果显示JEV E蛋白上与2F2可变区相互接触、作用的氨基酸位点有9个,即Ⅰ区的13位谷氨酸、16位丝氨酸、37位天冬氨酸和300位苏氨酸,Ⅲ区的336位赖氨酸、347位天冬氨酸、354位亮氨酸、387位精氨酸和388位甘氨酸残基.其中Ⅰ区13位谷氨酸、16位丝氨酸和37位天冬氨酸可能是中和表位必需的氨基酸.Ⅲ区的387位精氨酸和388位甘氨酸位于优势中和抗原表位区域,336位赖氨酸与已报道的337位中和表位非常接近.结论 通过计算机建模确定JEV E蛋白上有9个与单克隆抗体2F2作用的主要氨基酸位点,为利用E蛋白突变体阐明2F2单抗的中和机制提供了依据.
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寨卡病毒E蛋白的原核表达及鉴定
目的 应用原核表达载体pET-28a表达ZIKV主要结构蛋白E蛋白, 并对反应条件进行优化, 为ZIKV亚单位疫苗的研究奠定基础.方法 从GenBank检索ZIKV基因组, 合成E基因并进行密码子优化, 以提高原核表达效率.设计引物, 以合成的E基因为模板PCR扩增ZIKV E基因, 用BamHI和HindIII进行双酶切后连接表达载体pET-28a, 构建原核表达重组质粒pET28a-ZIKV E, 转化大肠埃希菌BL21 (DE3) 进行目的蛋白的表达, 并对适IPTG诱导浓度进行优化.结果 pET28a-ZIKV E经酶切及测序鉴定均构建正确.用重组质粒转化DE3, 当加入IPTG终浓度为2mmol/L, 成功表达出分子质量单位 (Mr) 为56×103重组ZIKV E蛋白, 与理论分子质量相符合.Western blot检测重组蛋白可被His标签抗体识别.结论 成功构建原核重组载体pET-28a-ZIKV E, 表达的重组蛋白具有免疫反应性, 为ZIKV亚单位疫苗的研制奠定了基础.
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登革病毒3型E蛋白的原核表达及抗体的制备
目的 原核表达并纯化登革病毒3型(DENV-3)E蛋白,并用于制备其抗体.方法 采用PCR技术克隆DENV-3 E蛋白基因,插入原核表达质粒载体pET-32a(+),转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经纯化后,免疫家兔,制备DENV-3 E蛋白抗血清,并用于Westernblot鉴定.同时,采用ELISA测定其抗体效价,并初步应用于DENV-3的检测.结果 重组表达载体经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为65×103,主要以包涵体形式表达;用纯化的包涵体蛋白免疫家兔后,获得的特异性抗血清效价为1∶20 480,该血清可与DENV-3发生特异性反应.结论 本研究原核表达并纯化了DENV-3 E蛋白,制备了高滴度的特异性兔抗血清.制备获得的DENV-3 E蛋白抗体可用于登革病毒的鉴定,为登革病毒相关研究奠定了基础.
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流行性乙型脑炎病毒活疫苗株SA14-14-2基因稳定性研究
目的通过研究流行性乙型脑炎活疫苗减毒株基因稳定性,从分子水平证实流行性乙型脑炎活疫苗的遗传稳定性. 方法分析流行性乙型脑炎活疫苗主种子、工作种子及其相应的疫苗病毒E蛋白基因核苷酸和氨基酸序列,并与其强毒株和基因库中乙脑病毒减毒株(AF315119)比较. 结果乙脑活疫苗主种子、工作种子及其相应的疫苗病毒的E蛋白基因核苷酸序列完全相同.这些病毒E蛋白的氨基酸序列与基因库中乙脑病毒弱毒株(AF315119)比较显示第E447位点氨基酸有差异. 结论乙脑病毒活疫苗减毒株遗传学特性稳定.
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我国两株森林脑炎病毒的生物学性质及E蛋白基因核苷酸序列的比较
目的:比较我国1953年从患者脑组织分离的森张株和2001年从患者血清中分离的MDJ01株森林脑炎病毒(TBE)的生物学特性及E蛋白基因核苷酸序列的变化,分析TBE病毒 E蛋白基因的变化与功能的关系,从分子水平上探讨我国TBE的传播、流行规律及致病机制.方法:两株病毒同时接种乳鼠和BHK/21细胞,观察两株病毒对乳鼠和BHK/21细胞的致病性;从两株病毒感染的BHK/21细胞中提取病毒的RNA,对E蛋白基因进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接,分别进行克隆测序.结果:森张株对乳鼠和BHK/21的致病性均比MDJ01株明显;两株病毒E蛋白基因长为1 488 nt,编码496个氨基酸, 核苷酸的变异为33个,导致了2个氨基酸的变化,第一个氨基酸的变异发生在113位(MDJ01株由 I变成V),第二个氨基酸的变异发生在163位(MDJ01由P变成A), 两株病毒核苷酸序列的同源性为97.8%,推测的氨基酸序列的同源性为99.6%.与国外远东株比较,森张株核苷酸序列的同源性稍高于MDJ01株,与欧洲株、西伯利亚株的同源性基本一致.结论:新分离株MDJ01对细胞和乳鼠的致病性稍低于1953年分离的森张株,E蛋白基因的核苷酸序列分析表明两株病毒同属于远东亚型,推测MDJ01株可能是由森张株在自然界长期演变而来.
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影响iNKT细胞分化的信号通路研究进展
iNKT细胞是一群连接固有免疫和适应性免疫的特殊桥梁细胞,在胸腺中发育并分化.近年研究发现,E蛋白家族(E2A、HEB)和早幼粒白血病锌指蛋白(PLZF)是调控iNKT细胞分化早基础的转录因子,在此基础之上,通过激活细胞内不同信号通路包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、TGF-β /SMAD通路、PI3K/Akt/mTOR通路等,iNKT细胞可分化为五个亚群,至今研究较为透彻的为iNKT1、iNKT2、iNKT17亚群.就上述三条通路对iNKT细胞分化的影响展开综述.
关键词： iNKT细胞 信号通路 细胞分化 E蛋白 早幼粒白血病锌指蛋白 -
鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
目的 用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV) AH-F10株E基因,并克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒pET32a-E,表达E蛋白.方法 重组表达质粒转化感受态细胞BL21 (DE3),经IPTG诱导后,获得含6个His标签的融合蛋白,大小约54 kDa.表达的蛋白以包涵体形式存在.对目的蛋白进行纯化,用纯化的E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体血清.结果 SDS-PAGE和Western blot试验结果表明E基因在大肠埃希菌中成功表达,并能与抗DTMUV多克隆抗体产生特异性反应,具有良好的反应原性.间接免疫荧光试验表明免疫小鼠后获得的多克隆抗体能与DTMUV反应.结论 本研究为DTMUV新型疫苗和诊断试剂盒的进一步研究奠定了基础.
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登革病毒1型E蛋白第三结构域的原核表达及其免疫原性
目的 在大肠埃希菌中表达登革病毒(Dengue virus,DENV)1型(DENV-1)E蛋白第三结构域(EⅢ),并分析重组蛋白的免疫原性.方法 利用PCR技术从质粒pMD-D1 prM/E中扩增DENV-1的EⅢ序列,插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-D 1EⅢ,转化至E coli Rosetta2(DE3)中,IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备多克隆抗体,采用Western blot法检测抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体滴度,蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)检测中和抗体效价.用纯化的重组蛋白免疫经腹部皮下多点注射BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后,用DENV-1(Hawaii株)经脑内攻击,分析重组蛋白对小鼠的免疫保护力.结果 重组原核表达质粒pET-D1EⅢ经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为33 000,主要以可溶性形式表达,占重组菌裂解上清蛋白量的52.37％;纯化的纯度可达90％以上,浓度达2 mg/ml;制备的多克隆抗体特异性强,效价高;重组蛋白能保护57.1％的小鼠免受致死剂量DENV的攻击.结论 成功在E.coli Rossetta2(DE3)中高效表达了DENV-1 EⅢ蛋白,纯化的重组蛋白免疫家兔获得的多克隆抗体具有较强的特异性和较高的效价,且在小鼠免疫保护试验中显示出较好的保护力.本实验为进一步研究E蛋白的功能和登革新型疫苗的开发奠定了基础.
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乙型脑炎病毒E蛋白毒力关键位点的正向验证
目的 将乙型脑炎野毒株SA14囊膜蛋白(envelope,E)氨基酸残基107位点(E107)和138位点(E138)突变为乙型脑炎减毒株SA14-14-2的相应位点,正向分析两个氨基酸位点突变在乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)减毒中的作用.方法 通过融合PCR方法分别扩增含有E107(1296-T)、E138(1389-A)、E107+138(1296-T/1389-A)突变位点的PCR片段,Kas Ⅰ和BglⅡ酶切后替换乙型脑炎强毒SA14的嵌合病毒SA14-14-2/SA14的相应区域,构建3个突变株病毒的全长克隆,转染BHK21细胞获得突变株病毒.测定并比较3个突变株和嵌合病毒SA14-14-2/SA14、疫苗株SA14-14-2的蚀斑大小及细胞增殖特征、小鼠脑内神经毒力、小鼠皮下感染人脑能力,分析E107、E138位点突变对JEV的减毒作用.结果 测序结果表明成功构建了3株突变株病毒,其中E107单位点突变对小鼠脑内神经毒力和皮下感染人脑能力无显著改变,蚀斑形态和细胞增殖能力也无明显变化.E138单位点突变及E138和E107双位点突变使病毒脑内神经毒力和皮下感染人脑能力急剧降低,其中E138和E107双位点突变使病毒皮下感染人脑能力完全消失,并且E138单位点突变以及E138和E107双位点突变病毒蚀斑较疫苗株SA14-14-2和嵌合病毒SA14-14-2/SA14明显偏小,但增殖能力有明显升高.结论 E138位点突变对JEV SA14的减毒起关键作用;在E138位点突变的前提下,E107位点与E138位点有显著的协同作用.
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乙型脑炎病毒E蛋白基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达
目的在大肠埃希菌中表达乙型脑炎病毒E蛋白.方法反转录聚合酶链反应(PCR)扩增乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白基因,克隆人原核表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌BL21(ED3).经异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹分析表达产物.结果本室所保存毒株的E蛋白与已发表的序列比较,有5个核苷酸改变,可分别导致氨基酸替代.所表达的E蛋白的相对分子质量约为50 000,表达量约占菌体总蛋白的35%.结论在大肠埃希菌中成功地表达了JEV E蛋白,为制备JE实验室诊断抗原和分析E蛋白基因结构与功能的关系打下了基础.
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寨卡病毒E蛋白及第三结构域的原核表达和多克隆抗体制备
目的 在大肠杆菌中克隆表达和纯化寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)包膜糖蛋白(Envelope Protein,E)及第三结构域(Envelope DomainⅢ,EDⅢ),并制备两种免疫原的鼠多克隆抗体.方法 通过Vero-E6细胞培养扩增ZIKV,提取病毒总RNA并反转录为cDNA,利用E和EDⅢ基因的cDNA序列构建原核表达载体pET32a/E和pET28a/EDⅢ,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni-柱亲和层析法纯化蛋白.以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清,间接ELISA法测定效价,Western Blot检测特异性.结果 成功表达并纯化重组蛋白E和EDⅢ,获得的多克隆抗体效价均达到1∶409 600,Western Blot检测多克隆抗体可特异性识别重组E蛋白和EDⅢ以及天然E蛋白.结论 成功制备出特异性抗寨卡病毒E蛋白和EDⅢ的鼠源多克隆抗体,为深入探索寨卡病毒致病机制、检测方法和免疫策略奠定了研究基础.
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登革Ⅱ型病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ结构域在大肠杆菌中的表达及免疫反应性鉴定
目的 在大肠杆菌中表达登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第一,二结构域(DⅠ/Ⅱ)并进行免疫反应性鉴定.方法 登革II型病毒接种乳鼠,提取总RNA,经RT-PCR扩增目的 基因片段.双酶切PCR纯化产物和质粒pET-28a(+)并连接构建重组质粒pET28a- DV2-E-D1&2.筛选阳性菌落,提取质粒并转化感受态细胞,IPTG诱导表达目的 蛋白并进行SDS-PAGE分析,Western blot 鉴定.结果 RT-PCR扩增得到约900 bp的目的 基因片段,双酶切及测序分析表明,插入序列正确且开放读码框正确.重组菌诱导后在37 kD位置有明显的诱导后表达带,其大小与预测值一致.经12%SDS-PAGE分析,显示重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中;Western blot结果 显示重组蛋白与His·Tag单抗和登革病毒单抗(D1-11)均发生反应.结论 成功地在大肠杆菌中表达登革II型病毒包膜糖蛋白(E)的DⅠ/Ⅱ,免疫反应性鉴定结果 表明其具有良好的免疫反应性.
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登革2型病毒E基因的表达及应用于血清学检测
目的 利用大肠杆菌表达登革病毒2型外膜蛋白,获得重组抗原应用于血清学检测.方法 用RT-PCR法扩增登革2型病毒去除C端100个氨基酸的外膜蛋白基因片段,与表达载体pET-30a连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白用电洗脱法进行纯化.纯化的重组蛋白用间接ELISA法检测登革2型感染者血清,检测结果 与间接免疫荧光法、澳大利亚Panbio试剂进行比较.结果 重组质粒构建成功,经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达重组蛋白.纯化的重组蛋白用于检测登革2型感染者血清,以IFTA作为参照标准,其敏感性为95.6%,特异性为96.8%.与澳大利亚Panbio IgG捕获法ELISA试剂盒检测结果 相比,两种方法 对登革2型IgG的检出率无统计学意义(P>0.05).结论 成功通过大肠杆菌表达登革2型去除C端疏水区的外膜蛋白,重组抗原可应用于血清学检测.
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我国登革2型病毒分离株E蛋白B抗原区的表达与鉴定
目的 登革2型病毒(DEN2)E蛋白B抗原区的融合表达、纯化和抗原性初步分析.方法 将DEN2 GZ14株E蛋白B抗原区基因连接到克隆载体pGEM-T并转染E.coli DH5α,酶切后连接至表达载体pET-32a(+)并转染E.coli BL21,IPGT诱导表达,Western Blot和间接ELISA分析表达产物的抗原性.结果 含有DEN2 E蛋白B抗原区基因质粒的表达菌表达了相对分子量为31kDa的融合蛋白,Western Blot分析表明其能与小鼠多克隆抗体发生特异性反应,间接ELISA分析其与10例登革2型病毒感染者血清发生阳性反应.结论 获得的DEN2 GZ14株E蛋白B抗原区的基因表达蛋白有良好的抗原性.
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SARS病毒E蛋白基因与EGFP基因在BHK-21细胞中的融合表达
目的:构建SARS病毒E蛋白基因的真核表达载体,观察E蛋白基因在BHK-21细胞中的正常表达及定位.方法:用PCR方法扩增E蛋白基因,上、下游引物两端分别设计EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,产物双酶切后定向克隆于pEGFP-N1载体,构建真核表达载体pEGFP-E,脂质体法转染BHK-21细胞,荧光显微镜观察E蛋白基因的表达.结果:经酶切和DNA序列测定鉴定,E蛋白基因正确插入到增强绿荧光蛋白EGFP基因上游,荧光显微镜显示E蛋白表达于细胞浆内,包膜上也有分布.结论:在BHK-21细胞中成功表达了SARSCovE-EGFP融合蛋白,蛋白定位于细胞浆内.
关键词： 严重急性呼吸道综合征 E蛋白 基因表达 转染 -
西尼罗病毒E蛋白的B细胞表位预测
目的:预测西尼罗病毒E蛋白的B细胞表位.方法:根据西尼罗病毒E蛋白基因组序列,采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和JamesonWolf抗原指数方案,辅以对E蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,预测西尼罗病毒E蛋白的B细胞表位.结果:后推测西尼罗病毒E蛋白的B细胞表位有可能位于N端第35-42,147-156,191-198,226-249,329-337,375-382区段,另外E蛋白N端第275-284,313-320,396-403区段也可能存在B细胞表位.结论:应用多参数预测E蛋白的B细胞表位,为进一步研究西尼罗病毒的蛋白特征、研制疫苗和制备单克隆抗体奠定了基础.
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登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核载体的构建及蛋白表达
目的 体外扩增登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列,构建pET28a(+)- ME、pET28a(+)- NE,分析其在E -coli BL21中的表达.方法PCR方法扩增(DENV-2)M株、NGC株E基因部分序列并构建原核重组载体pET28a(+)-ME、pET28a(+)- NE,将重组载体转化E-coli BL21,IPTG诱导表达,采用镍离子亲和层析的方法纯化目的蛋白并用SDS - PAGE电泳和Western - Blot进行鉴定.结果 经双酶切、PCR和测序证实成功构建原核重组载体pET28a+ -ME、pET28a(+)- NE,Western - Blot证实成功诱导出目的蛋白,SDS-PAGE电泳证实亲和层析法纯化后得到较高纯度的目的蛋白.结论 检测到目的蛋白的表达,经纯化后得到纯度约为90％的目的蛋白,为研究登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E蛋白在致病机制方面奠定了一定的基础.
