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不对称PCR制备单链探针检测登革Ⅱ型病毒复制型RNA和复制中间体RNA
登革病毒是具包膜的单股正链RNA虫媒病毒,病毒的复制过程发生在感染细胞胞浆,复制型(RF)RNA是病毒半保留复制的循环模板,复制中间体(RI)RNA的合成则是病毒复制所必需的.经RT-PCR获得的DNA模板进行不对称PCR扩增,当限制性引物终浓度为250nmol/L,两引物比例为100∶1时,即得到不对称PCR的预计单链和双链DNA产物.此单链产物用于标记探针进行核酸杂交.结果表明不对称PCR制备单链探针进行核酸杂交可用于检测病毒复制型RNA和复制中间体RNA的合成.
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白纹伊蚊干燥卵保存登革2型病毒的实验研究
感染登革2型病毒的白纹伊蚊卵在(25±1)℃、光照14 h/天,75%±5%RH的相对干燥环境中保存42天,分别采用C6/36细胞培养分离病毒和RT-PCR方法,检测卵孵化的F1代蚊虫感染率.第1个生殖营养周环F1代蚊虫未检测和分离到病毒,PCR检测第2生殖营养周环蚊虫批阳性率为26.7%,低感染率为1∶112.5;第3生殖营养周环蚊虫批阳性率为27.8%,低感染率为1∶108.统计学检验结果表明第2和第3生殖营养周环卵孵化的F1代蚊虫感染率没有达到显著性水平(P＞0.05).结果表明感染白纹伊蚊卵在75%±5%RH的相对干燥环境中保存42天后,能在孵化的子代蚊虫中检测和分离到病毒,证实伊蚊卵在干燥环境中能够保存卵内病毒.
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围食膜在蚊虫对登革Ⅱ型病毒中肠感染屏障中的作用
通过透射电镜观察了致倦库蚊和白纹伊蚊围食膜的形成特点及登革Ⅱ型病毒感染蚊虫中肠上皮细胞的规律,针对围食膜在蚊虫对登革Ⅱ型病毒中肠感染屏障中的作用进行了探讨.结果表明:DEN-2能在吸血2h内侵染白纹伊蚊上皮细胞并大量复制,而经过一定的外潜伏期仍不能侵染致倦库蚊的上皮细胞,提示致倦库蚊对DEN-2存在中肠感染屏障.而从围食膜形成的时间及病毒感染的规律推测,围食膜在中肠感染屏障中不是决定性的因子.
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垂直感染登革病毒对白纹伊蚊滞育卵孵化及F1代成蚊产卵量的影响
本文用低氧水刺激感染登革Ⅱ型病毒的白纹伊蚊滞育卵孵化,按时间顺序共收集孵化的7批幼虫,仅在先孵化的两批幼虫中检测到病毒,而在此之后孵化的幼虫都没有检测到病毒,推测感染病毒的滞育卵在低氧水的刺激作用下比没有感染病毒的滞育卵更易解除滞育,使得先孵化的蚊虫检测的阳性率较高.感染滞育卵孵化的幼虫低感染率为1:131.25(0.76%),明显低于非滞育卵低感染率1:82.5(1.21%),即垂直感染登革病毒影响卵的孵化和低龄幼虫的成活.单管饲养法获得经感染滞育卵孵化的F1代单只雌蚊产卵量,被感染的白纹伊蚊平均单只雌蚊产卵量与未感染雌蚊没有显著性差异(P＞0.05),即垂直感染病毒对F1代雌蚊产卵量无显著影响.
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蚊媒刺叮对Balb/C小鼠感染登革Ⅱ型病毒的增强作用
登革热/登革出血热是我国重要的蚊媒病之一,白纹伊蚊和埃及伊蚊是主要媒介蚊种.本研究以Balb/C小鼠为实验动物,探讨白纹伊蚊唾液对登革病毒感染宿主的增强作用.结果显示,在感染剂量相同的情况下,如果Balb/C实验小鼠预先被一定数量的白纹伊蚊叮咬以后再皮下接种病毒,实验小鼠感染登革病毒的程度有所提高,产生的病毒血症持续时间相对延长,从持续1～2天延长到4天左右,抗体产生阶段血清中的抗体滴度明显低于不被叮咬实验组,但后期抗体滴度差异不显著,腹腔巨噬细胞感染登革病毒的阳性率及感染的时间动态曲线也有明显差异,感染高峰期延迟,接种后第1天叮咬组的感染阳性率明显低于对照组,而在第2天病毒感染达到高峰,叮咬组感染阳性率明显高于对照组,以后逐渐下降,与对照组下降趋势类似,但感染水平一直略高于不被叮咬组.上述结果说明实验小鼠被媒介蚊虫叮咬以后变得相对容易被登革病毒感染,媒介蚊虫叮咬小鼠时分泌的唾液可能对宿主的免疫反应系统有一定作用,对登革病毒感染宿主有一定推动作用.
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登革Ⅱ型病毒SYBR GreenⅠqRT-PCR方法的建立
目的 建立敏感、特异、快速的检测登革Ⅱ型病毒(DENV-2)SYBR Green Ⅰ qRT-PCR方法.方法 根据GenBank上发表的DENV-2株核苷酸序列.应用Primer Express 3.0软件在保守区设计特异性引物,优化SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件,利用Sanger测序验证该方法的特异性和敏感性.结果 该方法与其他血清型登革病毒、流感病毒等均无交叉反应,低检出20个病毒拷贝/μl RNA.检测14份已知阳性和阴性血清,结果与预期一致.结论 本研究建立的DENV-2 SYBR Green Ⅰ qRT-PCR特异性强、敏感性高,可用于输入性DENV-2早期感染诊断.
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白纹伊蚊经滞育卵传递登革Ⅱ型病毒的实验研究
目的证明登革Ⅱ型病毒能否在白纹伊蚊滞育卵内存活并传至子代.方法采用逆转录-聚合酶链反应检测病毒,C6/36细胞培养分离病毒.结果能在白纹伊蚊滞育卵内检测到病毒,且滞育卵解除滞育后,子1代幼虫和成蚊中均检测到病毒,总的批阳性率为9.6%,子代低感染率为1:294.3;第一个生殖营养周环子代未分离到病毒;第二、三生殖营养周环子代间低感染率差异无显著性(x2=0.01,P＞0.05).结论试验证明登革Ⅱ型病毒能在白纹伊蚊滞育卵内存活并传至子代.
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登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核载体的构建及蛋白表达
目的 体外扩增登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列,构建pET28a(+)- ME、pET28a(+)- NE,分析其在E -coli BL21中的表达.方法PCR方法扩增(DENV-2)M株、NGC株E基因部分序列并构建原核重组载体pET28a(+)-ME、pET28a(+)- NE,将重组载体转化E-coli BL21,IPTG诱导表达,采用镍离子亲和层析的方法纯化目的蛋白并用SDS - PAGE电泳和Western - Blot进行鉴定.结果 经双酶切、PCR和测序证实成功构建原核重组载体pET28a+ -ME、pET28a(+)- NE,Western - Blot证实成功诱导出目的蛋白,SDS-PAGE电泳证实亲和层析法纯化后得到较高纯度的目的蛋白.结论 检测到目的蛋白的表达,经纯化后得到纯度约为90％的目的蛋白,为研究登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E蛋白在致病机制方面奠定了一定的基础.
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登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列具有干扰病毒复制的作用
目的 构建含有登革Ⅱ型病毒(DENV-2)前膜蛋白(prM)基因反向重复序列(irRNA)的重组质粒,评价其抑制病毒复制的效果.方法 DENV-2接种乳鼠,提取总RNA,在正义和反义引物两端分别加上XhoⅠ和EcoR Ⅰ的识别位点,将经RT-PCR扩增的prM全长基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重组质粒pcDNA-asprM;于另一对正义和反义引物两端引入酶切位点Nhe Ⅰ和BglⅡ,经RT-PCR扩增prM全长基因片段插入pMD18-T-vector中,形成含有正向序列的重组质粒pMD 18-T-prM.限制性内切酶Nhe Ⅰ和Kpn Ⅰ分别酶切重组质粒pMD18-T-prM和重组质粒pcDNA-asprM,得到片段prM和线性化载体pcDNA-asprM,连接构建成含有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA.筛选的阳性重组质粒pcDNA-irRNA用脂质体法转染至BHK-21细胞中,半定量PCR和实时荧光定量PCR分析评估该质粒抑制登革病毒复制的效果.结果 成功构建具有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA.经转染pcDNA-irRNA的实验组与未转染质粒阳性对照组相比,半定量PCR结果显示DENV-2攻击96 h后NS3的mRNA表达水平下降28％；实时定量PCR分析显示,DENV-2攻击72 h后实验组病毒拷贝数比阳性对照组少1.44倍,攻击96 h后实验组的NS1表达量明显低于阳性对照组(P＜0.05).结论 DENV-2 prM反向重复序列具有干扰病毒复制的效果,为登革病毒基因疫苗的研究提供理论依据.
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白纹伊蚊C6/36细胞登革Ⅱ型病毒结合分子的筛选
目的 筛选白纹伊蚊C6/36细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子.方法 提取C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,收集和纯化登革Ⅱ型病毒,用12％SDS-PAGE分析C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,转于硝纤膜上,用病毒覆盖蛋白结合实验(VOPBA)筛选C6/36细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子.结果 C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白经12％ SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和阴性对照液孵育,用抗登革病毒Ⅰ～Ⅳ单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在67 000和30 000的位置有特异性的条带出现,而阴性对照组无此条带.结论 用VOPBA法初步从白纹伊蚊C6/36细胞中筛选67 000和30 000等登革Ⅱ型病毒结合分子,其功能的鉴定正在进行.
关键词： 白纹伊蚊C6/36细胞 登革Ⅱ型病毒 结合分子 筛选 -
登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核蛋白多克隆抗体的制备
目的 翻备登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核蛋白的小鼠多克隆抗体并进行鉴定.方法 利用SDS-PAGE电泳的方法:将纯化后的登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核表达蛋白浓缩,切割目的条带并研磨制成抗原,皮下多点分次注射BALB/c小鼠,采用Western-Blot,间接免疫荧光法对小鼠血清多克隆抗体进行鉴定.结果 经SDS-PAGE电泳成功地将纯化后的登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原棱表达蛋白浓缩,并获取了抗登革Ⅱ型病毒M株,NGC株E基因部分序列原核表逸蛋白的多克隆抗体.结论 本实验中所用到的登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核蛋白为可溶性抗原,通过切胶研磨制成颗粒性蛋白抗原能获得良好的免疫效果,该方法制备的抗原浓度及纯度高,由此获得了高效价高特异性的多克隆抗体.
