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膜联蛋白A2对脑心肌炎病毒在BHK-21细胞中增殖的影响
膜联蛋白A2是一种参与调节多种病毒增殖的重要宿主蛋白.本研究通过构建过表达膜联蛋白A2的BHK-Anxa2细胞系及瞬时敲低膜联蛋白A2,探讨膜联蛋白A2对脑心肌炎病毒在BHK-21细胞中增殖的影响.通过RT-PCR从BHK-21细胞中扩增膜联蛋白A2全长cDNA,测序正确后克隆入pcDNA3.1整合表达载体中;用重组载体pcDNA3.1-Anxa2转染BHK 21细胞,经G418筛选获得抗性克隆,qRT PCR和Western blot试验证明BHK-Anxa2过表达膜联蛋白A2;EMCV感染试验证明BHK-Anxa2细胞中病毒滴度高于对照组.通过siRNA降低BHK-21细胞中膜联蛋白A2表达,EMCV感染试验证明膜联蛋白A2表达下降后EMCV增殖也随之下降.以上试验结果表明鼠膜联蛋白A2表达改变可导致病毒在BHK-21细胞中的增殖发生变化,提示膜联蛋白A2与EM-CV在BHK-21细胞中的增殖相关.
关键词： 脑心肌炎病毒(ECMV) 膜联蛋白A2 BHK-21细胞 siRNA -
蝙蝠呼肠孤病毒感染BHK-21和Vero-E6细胞形态发生的比较观察
目的 通过对蝙蝠呼肠孤病毒在BHK-21和Vero-E6细胞形态发生的比较研究,筛选出该病毒的佳宿主细胞.方法 将感染呼肠孤病毒XJV株的BHK-21和Vero-E6细胞用戊二醛、锇酸固定,制成超薄切片,用透射电镜观察.同时测定病毒滴度.结果 XJV在2种细胞中的适应程度小同,XJV更适于在BHK-21细胞中增殖.XJV在2种细胞中的形态发生不同,在BHK-21细胞中形成的包涵体呈典型的晶格状排列,在Vero-E6细胞中形成的包涵体呈杂乱的球状.XJV用BHK-21和Vero-E6细胞育传5代,病毒滴度分别为10~(5.5)TCID_(50)/ml和10~(4.5)～TCID_(50)/ml.结论 BHK-21细胞是蝙蝠呼肠孤病毒XJV株的佳宿主细胞.
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日本脑炎病毒受体功能缺陷细胞的筛选和鉴定
目的 筛选并鉴定日本脑炎病毒(JEV)受体功能缺陷的BHK-21细胞突变株.方法 用化学诱变剂ICR-191人工诱变JEV易感细胞系BHK-21,经JEV攻击,对存活细胞克隆化,RT-PCR筛选JEV RNA阴性细胞,用流式细胞术,免疫荧光和空斑实验鉴定其对JEV的敏感性.结果 筛选到1株JEV RNA阴性细胞3A10-3F.流式细胞术检测3A10-3F细胞与JEV的结合率为2.10%,免疫荧光和空斑实验证实其对JEV感染有相当程度的抵抗,在JEV感染复数MOI 1时3A10-3F细胞培养上清中JEV高滴度比BHK-21细胞中JEV高滴度下降2个数量级.结论用化学诱变法筛选到1株JEV受体功能缺陷细胞,为进一步鉴定JEV受体,深入研究JEV致病机理提供了有益线索.
关键词： 日本脑炎病毒(JEV) 病毒受体 BHK-21细胞 -
蛋清溶菌酶对人单纯疱疹病毒Ⅰ型抑制作用的实验研究
目的:观察蛋清溶菌酶(HEWL)对人单纯疱疹病毒Ⅰ型(hHSV-1)的抑制作用.方法:以HSV-1的敏感细胞BHK-21为实验细胞模型,以更昔洛韦为阳性对照药,以0.5%12-烷基磺酸钠(SDS)为阻断剂,采用细胞病变法(CPE)判定溶菌酶对hHSV-1的抑制效果.结果:HEWL对细胞的大无毒浓度(TC0)和半数中毒浓度(TC50)均>1 000μg·mL-1,HEWL对hHSV-1抑制作用的小有效浓度(MIC)为104.17 μg·mL-1,半数有效浓度(IC50)为46.88μg·mL-1,治疗指数(TI)为10.67.在平行对照试验中,更昔洛韦对BHK-21细胞的TC0和TC50均>500 μg·mL-1.更昔洛韦对hHSV-1抑制作用的MIC为7.81μg·mL-1,IC50为3.91 μg·mL-1,TI为64.0.5%SDS完全阻断了HEWL的抗病毒能力.结论:蛋清溶菌酶对HSV-1有较明显的抑制作用,作用强度与溶菌酶的浓度相关.
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犬呼肠病毒3型感染BHK-21细胞的超微结构观察
本实验采用免疫电镜负染、细胞超薄切片透射电镜观察,证实所分离的病毒为犬呼肠病毒.病毒粒子由致密的核心和包围着核心的双层衣壳组成,有的为空心衣壳,多呈晶格状排列;病毒在胞浆增殖,装配,通过细胞崩解释放;细胞浆内可见大量的微丝与微管结构,认为与病毒复制有关.胞浆与胞核中均可见到内容物不同,形态各异的包涵体.
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人源性双亲性穿膜肽PKV14的合成及其对BHK-21细胞的影响
目的 合成人源性双亲性穿膜肽RRTLRRRRAAQRCG(PKV14),并研究其细胞穿膜效果和对细胞活性的影响.方法 采用固相合成法合成PKV14,采用高效液相色谱和质谱对PKV14进行验证,使用荧光显微镜和酶标仪观察PKV14在BHK-21细胞系中的穿膜效果,采用MTT实验法检测PKV14的细胞毒性.结果 合成了PKV14肽段,并且PKV14对于BHK-21细胞系的穿膜效率极高,细胞毒性实验表明PKV14对BHK-21细胞活性无影响.结论 PKV14是具有高穿膜活性,安全低毒的新型人源性细胞穿膜肽,有作为药物载体的潜力.
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鸭坦布苏病毒感染对BHK-21细胞分泌胞外体的影响
目的:探讨鸭坦布苏病毒感染BHK-21细胞对胞外体的影响,进一步研究鸭坦布苏病毒的致病机制.方法:利用鸭坦布苏病毒AH-F10株感染BHK-21细胞,并设置未感染病毒的对照组.用PEG法提取感染病毒的BHK-21细胞和对照组细胞上清中的胞外体,通过电镜观察、Western blot检测对胞外体进行鉴定,并对提取的两组胞外体进行质谱鉴定分析.结果:电镜观察到纯度高的内部色浅、边缘浓染的杯状囊泡,直径30~160 nm.感染组胞外体的平均粒径大小大于对照组胞外体的平均粒径大小.Western blot试验中,均检测出CD9、CD63分子.应用液相质谱法从胞外体中鉴定出106种蛋白,其中感染坦布苏病毒组共检测出84种蛋白,对照组49种蛋白,有27种共同蛋白分子.结论:鸭坦布苏病毒感染BHK-21细胞会影响细胞胞外体的分泌,影响胞外体粒径大小及其蛋白组成成分.本试验为进一步研究坦布苏病毒的感染和致病机制奠定了基础.
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不同细胞对乙型脑炎病毒蚀斑减少中和试验的影响
目的 分别使用不同细胞测定乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)滴度及乙型脑炎灭活疫苗效价,分析不同细胞对检测结果的影响.方法 将JEV P3株接种至长满单层的MDBK、Vero、LLC-MK2、BHK-21细胞的6孔板,采用蚀斑试验测定JEV的PFU;将乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)免疫小鼠,取静脉血,分离血清,经56 ℃灭能30 min后,与JEV P3株混合,接种至长满单层的Vero、BHK-21、LLC-MK2细胞的6孔板,采用蚀斑减少中和试验检测乙型脑炎灭活疫苗的效价.结果 JEV在4种细胞上均可产生细胞病变(cytopathic effect,CPE),但在MDBK细胞上不形成蚀斑,病毒感染的Vero、LLC-MK2、BHK-21细胞的收获液病毒滴度分别为10.02、9.42和9.21 lgPFU/ml;3种细胞测定乙型脑炎灭活疫苗效价T值Vero＞LLC-MK2＞ BHK-21,其中Vero细胞与BHK-21和LLC-MK2细胞比较,蚀斑减少率及对应T值差异有统计学意义(P＜0.05),LLC-MK2与BHK-21细胞比较,蚀斑减少率及对应T值差异无统计学意义(P＞0.05).结论 4种细胞感染JEV后均可产生CPE,但MDBK细胞不能形成蚀斑;不同细胞测定疫苗效价,蚀斑减少率及对应T值也不同,其中Vero细胞测定T值大,BHK-21细胞测定T值小.
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登革病毒感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞CPE的比较及病毒检测
目的 比较感染登革病毒(dengue virus,DV)的C6/36 、Vero、BHK-21和THP-1细胞的CPE情况,并进行病毒检测.方法 将分离自云南西双版纳的Ⅲ型DV中国株D13053和广东省疾病预防控制中心惠赠的Ⅱ型中国株D10156,以5 MOI感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞,同时将Vero和C6/36细胞来源的DV,分别以5 MOI感染C6/36细胞,连续观察CPE至第10天,并利用DV通用引物,RT-PCR法鉴定细胞培养上清中的病毒.结果 C6/36细胞对DV敏感并有明显的病变,细胞几乎100％聚集、破碎并呈网格状;Vero、BHK-21细胞至第5天出现脱落、破碎和悬浮等病变,对DV有一定的敏感性;THP-1细胞至第10天未出现CPE.PCR核酸检测发现,感染DV的C6/36、THP-1、BHK和Vero细胞培养上清中可检测到DV,而Vero细胞来源DV感染的C6/36细胞未检测到DV.结论 DV对不同细胞系的感染能力和感染DV后CPE的表现形式存存掂大差异.
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不同新生牛血清对体外培养BHK-21细胞的影响
目的 比较不同新生牛血清对体外培养的BHK-21细胞的影响.方法 以不同厂家和同一厂家不同批次的共6种新生牛血清培养BHK-21细胞,观察细胞传代后在不同血清培养条件下的形态、增长倍数和细胞维持时间.结果 6号血清培养的细胞生长状态好,增长倍数高,维持细胞存活时间长;3号血清培养效果次之;2号、4号和5号血清培养的细胞至第4天仍未长满单层;1号血清培养的细胞基本未生长.结论 不同厂家和同一厂家不同批次的新生牛血清对BHK-21细胞体外培养的效果存在差异.
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神经生长因子对乙型脑炎病毒感染BHK-21细胞的抑制作用
目的 观察神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染地鼠肾细胞BHK-21的抑制作用.方法 将不同浓度的NGF(100、50、25、12.5、6.3、3.1、1.6和0.8μg/L)加入BHK-21细胞中,采用MTT法检测NGF对BHK-21细胞的毒性作用；将不同稀释度的JEV(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)JEV感染BHK-21细胞,蚀斑计数法测定病毒滴度；在JEV感染的BHK-21细胞中加入不同浓度的NGF,观察细胞的CPE情况,并通过蚀斑减少率分析NGF对JEV的抑制作用.结果 NGF浓度在100 μg/L以内对BHK-21细胞无毒性；JEV的滴度为Lg 8.70 pfu/ml;NGF(12.5 μg/L)+ JEV组BHK-21细胞病变程度明显减轻；随着NGF浓度的提高,蚀斑减少率也呈升高趋势(r=0.929,P＜0.05),NGF浓度为3.1μg/L以上时,蚀斑减少率达10％以上,具有明显的抗JEV效果.结论 NGF在浓度为0.8～100 μg/L的范围内,对JEV具有明显的抑制作用,为今后研究NGF抗病毒的作用机制奠定了实验基础.
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用原位RT-PCR对BHK-21细胞中的FMDV检测和定位
目的为了明确FMDV在BHK-21细胞中的复制和增殖部位,建立原位检测FMDV的方法.方法以地高辛标记的寡核苷酸作为探针,用间接原位RT-PCR技术对实验接种FMDV的BHK-21细胞中的FMDV RNA进行检测和定位.结果在接毒细胞的细胞质中有大量强阳性蓝染颗粒,阴性对照细胞中没有蓝染颗粒出现,也没有明显的背景染色.结论结果表明FMDV RNA在细胞的细胞质中进行复制和增殖,同时也表明原位RT-PCR是检测细胞内病毒的一种敏感、特异的方法.
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口蹄疫病毒感染BHK-21细胞的代谢热谱研究
本文应用高灵敏度的LKB2277生物活性检测仪测定FMDV感染BHK-21细胞的代谢热谱,并与传统方法测定的一步生长曲线进行比较,二者具有显著的相似性.结果表明,微量热法通过对细胞及其受病毒感染的细胞体系代谢热的测定,能有效地监测病毒在宿主细胞内增殖的过程.该方法还提供了一种动态连续分析病毒感染增殖的新手段.
关键词： 口蹄疫病毒(FMDV) BHK-21细胞 一步生长曲线 代谢热谱 -
江苏省自然人群乙型脑炎抗体血清学监测
目的 了解江苏省正常人群流行性乙型脑炎(乙脑)免疫状况. 方法 采用蚀斑减少中和试验对2006-2009年收集的0～20岁血清标本3 258份进行乙脑抗体检测. 结果 乙脑抗体总的阳性率为70.35%,GMT为1:13.56. 结论 江苏省3岁以上人群乙脑抗体有保护作用,其阳性率及效价随年龄增加而增加,0和1岁组抗体水平较低,应该加强该年龄段人群的保护.
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登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列具有干扰病毒复制的作用
目的 构建含有登革Ⅱ型病毒(DENV-2)前膜蛋白(prM)基因反向重复序列(irRNA)的重组质粒,评价其抑制病毒复制的效果.方法 DENV-2接种乳鼠,提取总RNA,在正义和反义引物两端分别加上XhoⅠ和EcoR Ⅰ的识别位点,将经RT-PCR扩增的prM全长基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重组质粒pcDNA-asprM;于另一对正义和反义引物两端引入酶切位点Nhe Ⅰ和BglⅡ,经RT-PCR扩增prM全长基因片段插入pMD18-T-vector中,形成含有正向序列的重组质粒pMD 18-T-prM.限制性内切酶Nhe Ⅰ和Kpn Ⅰ分别酶切重组质粒pMD18-T-prM和重组质粒pcDNA-asprM,得到片段prM和线性化载体pcDNA-asprM,连接构建成含有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA.筛选的阳性重组质粒pcDNA-irRNA用脂质体法转染至BHK-21细胞中,半定量PCR和实时荧光定量PCR分析评估该质粒抑制登革病毒复制的效果.结果 成功构建具有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA.经转染pcDNA-irRNA的实验组与未转染质粒阳性对照组相比,半定量PCR结果显示DENV-2攻击96 h后NS3的mRNA表达水平下降28％；实时定量PCR分析显示,DENV-2攻击72 h后实验组病毒拷贝数比阳性对照组少1.44倍,攻击96 h后实验组的NS1表达量明显低于阳性对照组(P＜0.05).结论 DENV-2 prM反向重复序列具有干扰病毒复制的效果,为登革病毒基因疫苗的研究提供理论依据.
