首页 > 文献资料
-
蚊传黄病毒的蚊虫细胞受体研究现状
研究日本脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒这三种蚊传黄病毒在蚊虫细胞上的受体特性及功能,对于终揭示这三种蚊传黄病毒的致病机理,切断蚊传黄病毒传播途径具有重要的意义.本文介绍了这三种蚊传黄病毒相似的受体结合蛋白的结构与膜融合机制,综合论述了在C6/36细胞上受体研究的进展,推测这三种蚊传黄病毒可能在蚊虫细胞上有相同的受体分子.
-
南方五省口岸蚊类携带虫媒病毒调查
[目的]掌握南方口岸蚊媒携带病毒的本底资料,为蚊传疾病的预防控制工作提供依据.[方法]采用电动吸蚊器人工法和捕蚊磁场自动法采集南方5省口岸各类蚊虫.采集到的蚊类超低温送至实验室,研磨处理后用荧光PCR方法检测登革病毒、乙脑病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等重要蚊媒病毒,结果阳性的标本进一步进行PCR扩增和核苷酸序列测定分析;蚊标本研磨液同时用C6/36细胞进行虫媒病毒分离培养,出现细胞病变后分别用黄病毒科、甲病毒科各自的通用引物进行鉴定;对未能鉴定的未知病毒进一步用随机PCR方法进行扩增、克隆、序列测定、Blast搜索.[结果]从南方5省口岸采集到各类蚊虫12575只,鉴定后共分成254组.各组标本经荧光PCR方法检测,结果登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒均为阴性;检测到2份福建省来源三带喙库蚊的标本乙脑病毒核酸阳性,经乙脑病毒E基因引物PCR扩增、测序分析证实为G Ⅰ型病毒.254份标本经C6/36细胞分离培养出现42份细胞病变,用黄病毒科、甲病毒通用引物PCR扩增,均未得到特异片段.选取1份典型病变的细胞培养物进行随机PCR鉴定,结果发现了1种潜伏于C6/36细胞中的浓核病毒.[结论]南方5省口岸蚊媒中可能未携带登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等重要蚊媒病毒,只有少量蚊虫携带乙脑病毒,蚊虫体内检测到的G Ⅰ型乙脑病毒属于福建省首次发现,出现病变的C6/36细胞可能是由自身潜伏的1种C6/36细胞浓核病毒引起.
-
荧光定量PCR检测感染登革2型病毒C6/36细胞和埃及伊蚊复制动态研究
本研究采用实时荧光定量PCR (FQ-PCR)方法,检测感染登革病毒C6/36细胞1～7d及感染埃及伊蚊1、3、5、7、9、11、13 d后,病毒在细胞和蚊虫体内增殖的动态变化.结果显示,随着时间增加,登革病毒增殖出现规律性变化.登革病毒在感染细胞1～2d后增殖不明显,3d后病毒开始大量复制达到高峰,但6d后有所下降.在蚊虫体内1～7d病毒增殖不明显,9d开始快速复制达到高峰,但11～13 d后下降至病毒载量稳定.实验表明登革病毒在细胞内复制增殖的佳时间在接种病毒3d后,在蚊虫体内9d开始快速复制达到高峰增殖,到11 ～13 d后蚊虫体内病毒增殖稳定波动.
-
C6/36细胞感染登革Ⅱ型病毒后
本研究在C6/36细胞感染登革Ⅱ型病毒24h后,用DDRT-PCR对细胞基因表达的变化进行了研究,并对其中2条表达有变化的基因进行了序列分析,1条为感染后表达量增加的基因片段,1条为感染后表达量减少的基因片段,通过GenBank查询尚未发现同源序列.这一发现对于阐明登革病毒和其宿主细胞之间的关系,探讨病毒感染的细胞内机制有积极的意义.
-
C6/36细胞不同血清型登革病毒受体差异的研究
目的 研究登革病毒4个血清型在C6/36细胞上的受体差异.方法 用病毒与细胞受体结合的VOPBA方法进行鉴定. 结果 C6/36细胞的4个血清型登革病毒受体分子质量相同,约为35 ku. 结论 C6/36细胞上4个血清型登革病毒受体相同.
-
蚊抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定
目的建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系. 方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗药性品系cDNA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区;经T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到真核表达载体pIE1-3,构建重组昆虫细胞表达载体pIE1-3/chy,经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1-neo质粒共转染蚊细胞C6/36,通过G418选择培养,建立转染细胞系;用RT-PCR、Western blotting鉴定糜蛋白酶基因的转录表达. 结果成功构建了真核表达载体pIE1-3/chy,证明糜蛋白酶基因已转入C6/36细胞,建立了稳定转染细胞系,表达产物分子质量单位约30 ku,与理论值相符. 结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究糜蛋白酶基因与抗药性的关系奠定了基础.
-
白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段的克隆及其作为基因表达内参照的应用
目的 获取白纹伊蚊β-肌动蛋白基因序列并探讨其作为基因表达内参照的作用.方法 根据昆虫β-肌动蛋白核苷酸序列的高度保守区设计引物,通过PCR的方法从白纹伊蚊C6/36细胞中扩增获得白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,进一步通过RT-PCR的方法验证其在稳定转染空载体和40S核糖体蛋白S4(RPS4)基因的白纹伊蚊C6/36细胞中的表达.结果 获得白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,长911 bp,与其他几种蚊β-肌动蛋白基因对应序列的相似性在89%以上.在稳定转染空载体和RPS4基因的C6/36细胞中,均可稳定地扩增出目的基因.结论 成功获得了白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,并且该片段完全可以用作基因表达差异分析时的内参照基因.
-
日本脑炎病毒受体74×103分子的分离与初步鉴定
目的 分离和初步鉴定口本脑炎病毒(JEV)易感细胞C6/36和Vere细胞上受体分子.方法 应用免疫共沉淀(Co-IP)技术,从C6/36和Vero细胞分离与JEV结合的受体分子,做质谱分析鉴定和Western blot检测.用激光共聚焦技术(LSCM)观察候选受体分子在细胞膜上的定位及与JEV结合的情况.结果 经过Co-IP反应,从C6/36、Vem细胞上分离出多个与JEV结合的分子条带.质谱分析首次鉴定出一个蛋白,即C6/36细胞上与JEV结合的相对分子质(Mr)为74×103分子,为HSC70蛋白.进一步用抗HSC70抗体做Western blot,榆测剑从C6/36和Vem细胞膜上Co-IP分离出的74×103蛋白.LSCM观察到JEV吸附在C6/36细胞膜上时,HSCT0蛋白与JEV共定位.结论 C6/36细胞上Mr为74×103的HSC70可能是JEV的受体分子.
-
登革病毒感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞CPE的比较及病毒检测
目的 比较感染登革病毒(dengue virus,DV)的C6/36 、Vero、BHK-21和THP-1细胞的CPE情况,并进行病毒检测.方法 将分离自云南西双版纳的Ⅲ型DV中国株D13053和广东省疾病预防控制中心惠赠的Ⅱ型中国株D10156,以5 MOI感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞,同时将Vero和C6/36细胞来源的DV,分别以5 MOI感染C6/36细胞,连续观察CPE至第10天,并利用DV通用引物,RT-PCR法鉴定细胞培养上清中的病毒.结果 C6/36细胞对DV敏感并有明显的病变,细胞几乎100％聚集、破碎并呈网格状;Vero、BHK-21细胞至第5天出现脱落、破碎和悬浮等病变,对DV有一定的敏感性;THP-1细胞至第10天未出现CPE.PCR核酸检测发现,感染DV的C6/36、THP-1、BHK和Vero细胞培养上清中可检测到DV,而Vero细胞来源DV感染的C6/36细胞未检测到DV.结论 DV对不同细胞系的感染能力和感染DV后CPE的表现形式存存掂大差异.
-
不同冷冻速率冻存C6/36细胞复苏效果比较
[目的]选择C6/36细胞适宜冷冻速率.[方法]用4种冷冻速率冻存处于对数生长期的C6/36细胞,运用MTT法测定细胞活性,计算冷冻存活率,并同步观察复苏细胞形态.[结果]A法冷冻存活率(92.9%±1.5%)高于B法、C法和D法(71.6%±1.8%、69.9%±2.1%和35.2%±1.2%).光镜观察,A法冻存后细胞,复苏即时镜下90%以上的细胞呈现透明,类圆形饱满良好的活细胞形态;而B法、C法和D法冻存的细胞都有不同程度的形态性破坏,可见细胞碎片.[结论]A法是C6/36细胞的适宜冷冻速率,冷冻速率的改变对其冷冻存活率的影响很大(P＜0.01).
-
白纹伊蚊中肠组织和C6/36细胞与登革病毒相互作用蛋白的筛选
目的 筛选登革Ⅱ型病毒与白纹伊蚊中肠组织和C6/36细胞中的连接分子.方法 富集纯化登革Ⅱ型病毒,用12%SDS-PAGE分析提取的C6/36细胞膜蛋白和白纹伊蚊中肠组织总蛋白,将分离胶上的蛋白转于硝酸纤维素膜(PVDF)上,应用病毒覆盖蛋白结合试验(VOPBA)方法筛选白纹伊蚊中肠组织和C6/36细胞中表达连接登革Ⅱ型病毒的分子.结果 白纹伊蚊中肠组织总蛋白经12% SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和阴性对照液孵育,用抗登革病毒单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在分子量30 kDa的位置有特异性的条带出现,而阴性对照组无此条带;用同样的方法筛选C6/36细胞上表达蛋白,病毒孵育组在分子量30 kDa和40 kDa的位置出现特异条带,而阴性对照组无.结论 VOPBA结果显示分子量为30 kDa的分子在中肠组织与C6/36细胞中都能表达,具有连接登革Ⅱ型病毒的作用,对其氨基酸序列的鉴定和功能分析工作正在进行中.
-
淡色库蚊抗药性相关胰蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定
目的为进一步研究胰蛋白酶基因与抗药性的关系.方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗性品系cDNA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的胰蛋白酶(trypsin)基因编码区.T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到昆虫细胞表达载体pIE1-3,构建重组昆虫细胞表达载体pIE1-3/try.经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1-neo质粒共转染蚊虫细胞C6/36,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞.用RT-PCR、Western blotting鉴定胰蛋白酶基因的转录表达.结果酶切和PCR鉴定表明,成功构建昆虫细胞表达载体pIE1-3/try;证实胰蛋白酶基因已转入C6/36细胞,并建立稳定转染细胞系,成功地表达目的基因.结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究胰蛋白酶与抗药性的关系提供了良好的实验基础.
-
登革病毒组织培养技术
目的: 探讨对登革病毒敏感性不同的几株蚊子细胞和哺乳动物细胞的体外培养技术.方法: 对白纹伊蚊C6/36细胞、伪盾伊蚊Ap-61细胞和三株哺乳动物细胞LLC-MK2细胞、Vero细胞、BHK-21/31细胞进行体外培养,把登革病毒转染到上述细胞中,经传代培养后,在显微镜下观察.结果: 通过观察结果及时改进各细胞株的培养基的配制、消化方法和传代比例,各细胞株均能生长良好、单层致密、无污染,登革病毒转染实验呈阳性结果.结论: 实验结果证明白纹伊蚊C6/36细胞、Ap-61细胞、LLC-MK2细胞、Vero细胞、BHK-21/31细胞均为登革病毒敏感细胞,其中白纹伊蚊C6/36细胞敏感性较高,随着新的克隆细胞株的体外培养技术的成熟,组织培养已成为登革病毒分离、鉴定的毒力滴定中必不可少的一种常规实验技术.
-
C6/36细胞上登革2型病毒受体的免疫共沉淀
本文利用差速离心方法提纯的登革2型病毒、抗登革病毒单抗、病毒受体、耦合有G蛋白的琼脂糖珠之间特异性结合的作用,利用免疫共沉淀方法从C6/36细胞中分离鉴定出分子量约为35kDa受体蛋白;并用糖蛋白染色方法否定了此蛋白的糖基化特征.
