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DDRT-PCR法研究小鼠耐受全氟异丁烯中毒的相关基因
目的急性低剂量全氟异丁烯(PFIB)染毒后的活存小鼠可对致死量PFIB产生耐受性,本文旨在寻找与耐受有关的基因对揭示PFIB中毒耐受机制.方法采用静式全暴露法3次染毒PFIB,抽提耐受1个致死量PFIB活存动物的肺组织tRNA,采用DDRT-PCR方法,使用3个锚定引物和4个随机引物分别对耐受小鼠和对照小鼠肺组织总tRNA进行逆转录和PCR扩增反应,通过测序胶电泳和银染分析其基因表达差异,并对差异DNA片段进行克隆、测序.结果耐受PFIB的小鼠与对照鼠相比,在基因表达上发生了明显变化.对耐受小鼠特有的3个差异DNA片段进行克隆、测序,通过BLAST与Genbank中的基因比对显示,克隆的EST(expressed sequence tags)均与小鼠特定的基因高度同源.结论特异基因的表达是小鼠耐受PFIB的基础,耐受动物特有的3种差异表达EST对应的基因对于揭示PFIB耐受机理可能具有重要意义.
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半夏试管小块茎发育过程中相关基因差异表达的研究
目的:分析半夏试管块茎形成过程中总mRNA差异表达的变化规律,为研究半夏试管块茎形成的分子机制提供了信息.方法:利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR),分离和克隆半夏试管小块茎发育的相关基因片段.结果和结论:分离到了15个半夏试管小块茎发育过程中特异表达的cDNA片段,在GenBank中进行同源性比较发现6个没有同源序列与之匹配,推测为新的cDNA片断;3个片段推导的氨基酸序列分别与真核生物启动子,MADS-box蛋白和乙烯信号转导因子有高度同源性.半定量RT-PCR进一步证实它们存在,并在半夏块茎形成不同天数高度特异表达.
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半夏试管块茎银染mRNA差异显示条件的建立及优化
目的:建立半夏试管小块茎DDRT-PCR反应佳体系,为进一步研究半夏试管小块茎相关基因表达提供技术参考.方法:以半夏试管苗的叶柄、试管小块茎为材料,利用正交试验设计,研究模板.Mg2+,dNTPs,引物和DNA聚合酶等因素,对DDRT-PCR反应体系的影响.结果与结论:20μL的反应体系中含有dNTPs 150 pznol·L-1,Taq酶0.6 U,锚定引物2μmol·L-1,随机引物1μmol·L-1,Mg2+2.5 mmol·L-1,2μL10×buffer和2.5鹇的cDNA模板.各因素影响程度依次为raq酶＞cDNA模板＞dNTPs＞Mg2+＞引物.
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大鼠睾丸精子发生中差异表达基因RSD5的克隆与表达分析
为了分离、克隆精子发生相关基因，深入了解精子发生的分子机理，本文以大鼠睾丸曲细精管显微分离结合DDRT-PCR的方法，所得的不同区段中差异表达的EST(expressed sequence tag)筛选大鼠睾丸cDNA文库，获得一个新的cDNA序列-RSD5。RSD5 cDNA全长1556bp,编码176个氨基酸，GenBank接收号为AF146738。RSD5基因编码蛋白序列含有一个PEST基序，这是蛋白质快速降解的标志。Northern blot 分析结果显示，RSD5在睾丸组织和脑组织表达量较高，且在不同发育天龄的睾丸组织中具有显著的表达差异性。RSD5基因的表达特征及其编码蛋白的PEST基序提示RSD5蛋白可能在精子发生中具有重要作用。
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白纹伊蚊感染登革2型病毒后基因表达变化的研究
白纹伊蚊感染登革2型病毒24h后,和对照蚊虫一起提取RNA,用差异显示PCR(DDRT-PCR)技术对蚊虫感染病毒后基因表达的变化进行研究.白纹伊蚊感染登革2型病毒后,经过8条随机引物和3条3′端锚定引物配对扩增,发现了6条表达有差异的片段,其中5条为感染后表达量增加的片段,1条为感染后表达量减少的片段,并对这些片段进行了克隆和测序,通过GenBank查询,其中5条为未知序列,1条表达量增高的片段和果蝇核糖体蛋白S5基因有较高的同源性.这些差异片段的发现可能对探讨媒介蚊虫对登革病毒的易感性机理有意义.
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C6/36细胞感染登革Ⅱ型病毒后
本研究在C6/36细胞感染登革Ⅱ型病毒24h后,用DDRT-PCR对细胞基因表达的变化进行了研究,并对其中2条表达有变化的基因进行了序列分析,1条为感染后表达量增加的基因片段,1条为感染后表达量减少的基因片段,通过GenBank查询尚未发现同源序列.这一发现对于阐明登革病毒和其宿主细胞之间的关系,探讨病毒感染的细胞内机制有积极的意义.
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补肾益脑片对加速衰老小鼠P10/Ta小鼠神经细胞衰老相关基因表达的调节
目的 研究补肾益脑片抗衰老的分子机制.方法 应用DDRT-PCR研究补肾益脑片提取物对SAM(senescence-accelerated mouse)P10/Ta小鼠原代培养的神经细胞基因表达的影响.结果 发现了10个差异表达片段,分别与下列基因或转录产物同源:小鼠mRNA克隆IMAGE 4235872,小鼠RIKEN cDNA A730024A03基因mRNA,小鼠血清淀粉样蛋白A3(SAA3),异种核蛋白AO(HNRNP AO),小鼠OVCAl(Dph211)mRNA,蛋白酶体26S亚单位,ATP依赖线粒体RNA螺旋酶,小鼠线粒体核蛋白s31(Mrps31),小鼠CX43 gene,小鼠tRNA-lie.结论 补肾益脑片可能通过影响与衰老相关的基因表达发挥抗衰老作用.
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大鼠精子发生中一种新的阶段性表达基因全长cDNA的分离
精子发生是一系列基因严格按照时空顺序相继转录表达的过程.寻找和研究不同时期、不同发育阶段的差异表达基因,将有助于终阐明精子发生的机理.由于大鼠生精细胞在曲细精管内的排列极为有序,本研究采用曲细精管分段分离结合差异显示PCR(DDRT-PCR)的方法,寻找精子发生中差异表达的基因.
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小鼠增龄相关性胸腺基因的克隆
目的:用基因差异显示技术研究小鼠胸腺增龄相关基因.方法:利用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)技术对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行分析,获得差异显示的表达序列标签(ESTs).选其1个1月龄高表达的EST为探针,从小鼠胸腺cDNA文库中筛选出一个827 bp的阳性克隆,并用PCR扩增延长为1 406 bp的cDNA片段(mt22-1406).结果:同源性分析结果表明, mt22-1406含一编码438AA的开放阅读框,与人延伸因子1γ(EF1γ)高度同源,其Genbank接收号为BE241062.结论:获得一个含完整开放阅读框与小鼠胸腺增龄相关的基因.
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DDRT-PCR技术在中药研究中的应用
概述了mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)的基本原理.对近年来DDRT-PCR技术在中药作用机制、中药复方作用机制、中药植物生物学方面的研究现状做了综述.展望了该技术在中药研究方面的应用前景.
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有无上皮细胞共培养条件下前列腺增生间质细胞的基因差异表达
目的 研究前列腺增生间质细胞在有无上皮细胞共培养条件下的基因差异表达.方法 利用前列腺间质与上皮细胞共培养模型及DDRT-PCR技术,对单独培养的前列腺增生间质细胞和与上皮细胞共培养的前列腺增生间质细胞的mRNA进行差异表达分析,获得差异表达片段(ESTs);并对这些ESTs进行斑点杂交印迹分析及克隆测序,将所测阳性克隆的cDNA序列与网上公用核苷酸数据库中的已知序列进行同源性比较.结果 得到差异表达片段44个;经同源性分析,有29个ESTs与已知基因有较高同源性,15个ESTs为新的cDNA片段.结论 前列腺增生间质细胞在有无上皮细胞共培养条件下,存在差异表达基因,这些基因可能在前列腺间质细胞与上皮细胞的相互调控中发挥作用.
