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银染mRNA差异显示方法分离环磷酰胺致突变相关基因片段的探讨
环磷酰胺(CP)是目前临床上常用的肿瘤化疗药物和免疫抑制剂,在遗传毒理学实验中常用作致突变和胚胎致畸的阳性对照药物.它主要通过攻击肿瘤细胞和正常细胞DNA,抑制其生长繁殖,干扰其功能.
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半夏试管块茎银染mRNA差异显示条件的建立及优化
目的:建立半夏试管小块茎DDRT-PCR反应佳体系,为进一步研究半夏试管小块茎相关基因表达提供技术参考.方法:以半夏试管苗的叶柄、试管小块茎为材料,利用正交试验设计,研究模板.Mg2+,dNTPs,引物和DNA聚合酶等因素,对DDRT-PCR反应体系的影响.结果与结论:20μL的反应体系中含有dNTPs 150 pznol·L-1,Taq酶0.6 U,锚定引物2μmol·L-1,随机引物1μmol·L-1,Mg2+2.5 mmol·L-1,2μL10×buffer和2.5鹇的cDNA模板.各因素影响程度依次为raq酶＞cDNA模板＞dNTPs＞Mg2+＞引物.
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吴茱萸遗传多样性的AFLP分析
目的:应用AFLP技术对吴茱萸的遗传背景进行研究,分析不同产区吴茱萸的遗传特性差异.方法:试剂盒提取吴茱萸幼嫩叶片基因组DNA,构建AFLP实验体系并筛选引物,对来自全国5个省份的46份样品进行遗传背景的研究；用NTSYS-pc 2.1软件对AFLP扩增结果进行聚类分析.结果:从72对AFLP引物中优选6对用于吴茱萸遗传背景的研究,通过研究发现在相关系数为0.53时,浙江地区的吴茱萸石虎变种样品与其他地区样品分开；石虎变种遗传差异比吴茱萸更显著并呈现出较强的地缘相关性.结论:吴茱萸遗传背景差异明显,AFLP分析方法可有效鉴别不同品种的吴茱萸,并能检测到地区间的差异.
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一种改良的变性聚丙烯酰胺凝胶中DNA银染显色方法
目的 对变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中DNA银染及显色方法进行改良,以得到简便、快速、经济、有效的DNA银染显色方法.方法 改良的方法省略了预处理、固定、用试剂终止显色过程等步骤,并无需中间用水冲洗、漂洗.结果 改良方法使PAGE中DNA银染显色全程时间缩短至15～20 min,且效果较好.结论 改良后的方法简捷有效,值得应用.
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应用自制微切割工具切割石蜡组织行PCR-银染
微切割技术是通过显微操作系统对欲选取的材料(组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等)进行切割分离并收集用于后续研究的技术.该方法尽可能地排除了背景细胞的干扰,大大提高了分子生物学检测手段的精确度[1].近年来,微切割-PCR-银染技术在肿瘤发病机制研究中的应用越来越多,但是目前从石蜡包埋组织中提取基因组DNA还有一定难度,在数量和质量上都不能令人满意[2].国外也有多种微切割-PCR技术的报导,但多以激光捕获微切割(LCM)为主[3],仪器设备昂贵,推广较困难.我们长期摸索在石蜡切片中用自制工具行微切割-DNA提取-PCR-银染的技术,总结出一套较高效、经济、稳定的技术方法.
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丝状真菌Pythium sp.GY1938菌株蛋白图谱染色方法的比较及优化
目的 探索制备灭蚊丝状真菌Pythium sp.GY1938菌株菌丝体可溶性蛋白图谱的佳染色方案.方法 采用不同的破壁方法制备Pythium sp.GY1938菌丝体可溶性蛋白,并通过SDS-PAGE进行蛋白质电泳分离,进一步采用考马斯亮蓝R-250染色法、Vorum银染法、EMBL银染法、Blum银染法4种染色方案分别进行凝胶染色,对不同染色方案的染色效果进行分析和比较.结果 对于Pythium sp.GY1938菌丝体可溶性蛋白样品中的中、高分子质量蛋白≥44 ku),考马斯亮蓝R-250的染色效果较好,且简单、快捷;对于低分子质量(<44 ku)的可溶性蛋白,Vorum银染法染色效果较好;Blum银染法和EMBL银染法的染色效果均不理想.结论 考马斯亮蓝R-250染色法和Vorum银染法均可应用于Pythium sp.GY1938菌丝体可溶性蛋白图谱的制备,前者适合对中、高分子质量蛋白染色,后者适合对低分子质量蛋白染色.
关键词： 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 考马斯亮蓝染色 银染 -
几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较
本研究对蛋白质染色法进行比较和分析,以求获得满足蛋白质组研究所需的适宜的蛋白质检测法.实验采用2-D电泳分离急性早幼粒白血病细胞株NB4的全蛋白及1-D电泳分离蛋白质分子量标准物,从蛋白质检测的灵敏性、质谱兼容性、操作的简便性等角度,比较了传统考马斯亮蓝染色法、胶体考马斯亮蓝染色法、改良考马斯亮蓝染色法和银染法4种蛋白质着色法对凝胶分离蛋白质的检测影响,探讨了影响蛋白质染色与鉴定的影响因素.结果显示,银染检测灵敏度高,但质谱鉴定相容性差,鉴定率近10%;改良考马斯亮蓝染色法检测灵敏度也高,可达4 ng/spot,质谱鉴定率可接近55%.结论:改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质检测灵敏度高,与质谱兼容好,能满足蛋白质组研究需要.
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增生性瘢痕表皮细胞双向电泳图谱的建立及差异蛋白展示
目的建立在体增生性瘢痕表皮细胞蛋白质分子双向电泳(2-DE)技术,筛选出增生性瘢痕表皮细胞较正常表皮细胞差异表达的蛋白质,为揭示表皮细胞在增生性瘢痕形成过程中的作用奠定基础.方法利用消化法分离出在体的增生性瘢痕组织中的表皮细胞,提取其中总蛋白质,利用双向电泳技术展示蛋白质分子的表达,通过Melanie 3.0软件对凝胶图像进行分析,将结果与数据库中正常表皮细胞2-DE图谱进行比较.结果建立了能够显示超过600个蛋白质点的在体增生性瘢痕表皮细胞双向电泳图谱,通过比较筛选出在位置、形状或密度上存在差异的蛋白质点24个.其中高表达的点有8个,低表达点有9个,表达缺失或极低表达点有4个,新发现蛋白质点3个.结论采用消化法分离在体增生性瘢痕表皮细胞建立其2-DE图谱的方法是可行的,为进一步进行增生性瘢痕相关性蛋白质组研究奠定了基础.初步筛选出的24个差异蛋白质点提示增生性瘢痕表皮细胞的异常可能与增生性瘢痕的形成有关.
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STR-PCR检测孕妇外周血浆中胎儿DNA基因型的初步研究
目的采用短串联重复序列(STR)多态位点的复合扩增方法,研究孕妇血浆中胎儿DNA基因型.方法采用STR多态位点即CSF1PO、TPOX、TH01(简称CTT)三个位点的复合扩增方法,对30例孕妇孕中期的血浆DNA进行扩增,并对扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染后观察结果.结果30例孕中期的孕妇中,16例从母体血浆中检出了父源性等位基因,5例可能检出了胎儿DNA,3例未检出胎儿DNA,6例扩增失败.结论STR多态位点的复合扩增,判断基因型简便、快速,结果容易判断,费用低,可用于父源性遗传病的产前诊断.
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应用试剂盒配合PAGE银染法分析SLC26A4基因IVS7-2 A＞G突变
目的 建立应用标准试剂盒和PAGE银染方法检测SLC26A4基因IVS7-2A>G突变的程序,探索大前庭水管综合症的快速筛查和诊断方法.方法 采用SLC26A4基因IVS7-2A>G突变诊断试剂盒配合PAGE胶电泳银染法检测经直接测序法确定的SLC26A4基因IVS7-2位点正常者109例,IVS7-2 A>G突变阳性者33例,并且和测序方法比较,验证此试剂盒配合PAGE银染法检测的有效性和准确性.结果 SLC26A4基因IVS7-2A>G突变诊断试剂盒配合PAGE胶电泳银染法检测结果证实阳性33例,其中纯合22例,杂合11例,与测序结果完全吻合.结论 SLC26A4基因IVS7-2A>G突变诊断试剂盒配合PAGE胶电泳银染法检测在分析SLC26A4基因IVS7-2A>G突变方面具有简单、价廉、结果直观的特点,适合在中国用于此突变的大规模筛查或预防性检查.
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关键词：
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中药紫菀AFLP技术参数的优化与分析
目的:探讨影响紫菀扩增片断长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)的各种因素,建立并优化紫菀AFl2反应体系,为研究紫菀分子品质性状的技术平台奠定基础.方法:CTAB法提取紫菀基因组DNA,分别用一步法和两步法进行酶切与连接,分别进行预扩增、选扩后,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染检测.结果:本研究建立了适用于紫菀的AFLP体系:用乙醇沉淀DNA,建立的模板不合PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂,可被限制性内切酶MseI和EcoRI完全酶切;确定两步法进行酶切、连接,酶切时间为37℃3h,连接时间为16℃过夜,缓冲液选用NEB公司Buffer 2;选择性扩增后的银染显色在10℃以下.结论:本研究建立的反应体系适用于紫菀基因组DNA的AFLP研究.
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非离子去污剂提高双向电泳银染后胶内酶切的效率
目的 改进二维凝胶电泳银染色后的胶内酶切方法,提高蛋白质的鉴定率.方法 应用超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱(HD-MS),对改进方法(酶切中加入非离子去污剂正十二烷-β-D-麦芽糖苷)和原有方法进行比较.结果 2D胶上的10个蛋白质斑点中的蛋白质用两种方法均得到明确的鉴定结果,但60％的蛋白质用改进方法鉴定的氨基酸序列覆盖率较原有方法明显提高.结论 改进后的方法简便,适用于凝胶为基础的蛋白质组学研究.
关键词： 银染 胶内酶切 正十二烷-β-D-麦芽糖苷 质谱 -
聚丙烯酰胺凝胶中DNA银染色检测方法的改进及其效果比较
目的:探索快速、经济的银染色方法.方法:本研究对前人文献所报道的一种银染检测方法的检测步骤和试剂用量进行了优化,省略了操作过程中的固定步骤,简化了停显液的组成成分.结果:优化后的方法在配制试剂时只需3种化学试剂,染色液中硝酸银的用量被减少至1.0 g/L,显影液中氢氧化钠的浓度被降低至10 g/L,DNA检测效果表明优化前后的两种检测方法的检测灵敏度均可达5 ng左右.结论:优化后的DNA银染色检测方法更加经济、快速.
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翻译起始因子EIF3-P66在快速老化模型鼠(SAMP/10)中的异常表达和针刺的调节作用
[目的]研究真核生物翻译起始因子EIF3-P66在快速老化模型鼠(SAM-P/10)中的表达状况和针刺的调节作用.[方法]采用差别显示(DDR-PCR)技术,分析SAM-P/10鼠伴加龄脑组织基因表达的变化及针刺的干扰作用.[结果]真核生物翻译起始因子EIF3-P66的表达伴增龄发生规律性的变化,伴快速老化表达增加,而针刺可下调其表达.同源性分析表明该序列与小鼠及人的翻译起始因子EIF3-P66高度同源.[结论]SAM-P/10的快速老化可能与EIF3-P66的异常表达有关,而针刺延缓衰老的可能机制之一是通过改善EIF3-P66的异常表达,继而减少蛋白质合成异常而发挥作用.
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蜂毒素的SDS-PAGE质控方法研究
目的建立以SDS-PAGE进行蜂毒素质量控制的方法.方法将通过凝胶色谱法从蜜蜂毒中分离纯化所得到的蜂毒素,以SDS-PAGE法测定其相对分子质量,并通过凝胶成像扫描测定蜂毒素纯度.结果蜂毒素样品电泳后在凝胶块上显示为均一条带,相对分子质量约为2 800,含量为(90.59±0.85)%,与HPLC测定结果平行.结论SDS-PAGE法作为蜂毒素的质控方法,结果准确、可靠、简便.
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中国人食管鳞癌10q23微卫星不稳定和杂合性缺失初步探讨
食管癌是较常见的恶性肿瘤之一,早期诊断和积极治疗十分重要.食管癌在癌变发展的不同阶段均有原癌基因的激活和抑癌基因的失活.近年主要集中于研究癌基因c-myc、c-erbB-2、cyclin D1及抑癌基因Rb、p53、p16、APC/MCC等,但尚未发现与食管癌高度相关的特征性基因[1].
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10株人癌细胞基因组的微卫星不稳定性特征
背景：为了解实验室常用人癌细胞的微卫星不稳定性情况。
目的：从基因组微卫星水平分析各组织来源人癌细胞株的遗传背景差异。
方法：取10株指数生长期的人白血病、结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌细胞及2株人正常细胞(人脐静脉内皮细胞、人皮肤成纤维细胞)，提取细胞DNA，对BAT-25，BAT-26，CAT-25，NR-24，SEC-63五个几近单态性的微卫星位点进行PCR扩增，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染法对产物进行检测，同时用ABI 3720XL自动测序仪测序。
结果与结论：人脐静脉内皮细胞、人皮肤成纤维细胞的5个微卫星位点扩增片段长度具有一致性及稳定性，可作为正常对照。人结肠癌细胞、人膀胱癌细胞在BAT-25、BAT-26、CAT-25或NR-24位点扩增片段长度均较人脐静脉内皮细胞及人皮肤成纤维细胞缩短，缩短产度为7-13 bp，属于微卫星高度不稳定细胞。其他细胞在5个位点扩增片段的长度与人脐静脉内皮细胞、人皮肤成纤维细胞一致，属于微卫星稳定细胞。实验结果揭示了受试人癌细胞基因组微卫星不稳定性水平，为未来选择合适的细胞株进行药物活性筛选等试验奠定了基础。 -
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳三种银染方法比较
目的探讨DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)三种银染方法的特点及其适用性.方法采用非变性PAGE垂直板对不同稀释度的pBR 322 MspⅠ分子量标准进行电泳分离,利用二种硝酸银染色法和一种银氨染色法染色,分析其灵敏度和噪声.结果分子量Marker的所有条带都能染出灵敏度均为25 ng.在至少一个条带能染出的灵敏度方面,银氨染色法(6.25 ng)低于其他两种方法.结论时间方面Carlos等所建立的银染方法快,仅需20 min.银氨法的噪声低,结果易于保存.Brant等所建立的银染方法在实际应用中不占优势.
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PCR-SSCP分析方法的优化
目的:优化PCR-SSCP分析方法.方法:选择野生型Kir2.3质粒和突变型Kir2.3(I2123L)质粒为样本,其PCR结果的鉴定采用2%的琼脂糖凝胶EB显色,SSCP分析采用12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶DNA银染显色.PCR产物变性比较了三种方法:即碱变性、SDS变性、直接变性.聚丙烯酰胺凝胶根据丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺及甘油的比例设计了六个实验组,每组采用两种条件电泳,即:30mA恒流快速电泳和100V恒流过夜电泳.结果:选择直接变性的PCR产物作为变性上样液,并确定了三种凝胶配及该条件下适用的电泳条件.即:丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为49比1,凝胶中含1%甘油,4℃,500V高压电泳3min接着30mA恒流快速电泳3h;丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为49比1,凝胶中含5%甘油,4℃,500V高压电泳3min接着30mA恒流快速电泳3h;丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为29比1,凝胶中不舍甘油,4℃,500V高压电泳3min接着100V恒流过夜电泳12h.结论:条件优化的PCR-SSCP是一种筛查基因突变简便、有效的实验方法.
