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家蝇抗性相关P450基因的初步研究
为了在分子水平上研究拟除虫菊酯抗性家蝇的P450基因的特性,更好地研究其与抗性相关的机制,本研究根据在美洲地区的抗性家蝇品系(LPR)克隆的P450基因MDC YP6D1的保守序列设计合成引物,用PCR方法从北京地区的家蝇中也扩增出1条约210 bp的特异性片段,片段长度与原序列对应片段相近,说明北京地区的家蝇P450基因与MDCYP6D1间有很大的同源性.Hinf I酶切发现扩增产物上并没有相应的酶切位点,说明扩增产物与原序列MDCYP6D1的相应部分不一样,提示这一用PCR方法在北京地区的家蝇中扩增出的P450基因片段有可能对应一新的P450基因.PCR-SSCP结果显示扩增产物在一级结构上有一定的多态性,这一现象可能与P450基因在昆虫体内的复杂多样性有关.
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乳腺癌细胞周期调定点激酶基因突变的研究
目的 研究细胞周期调定点激酶基因(CHEK2基因)突变与乳腺癌的关系.方法 取65例乳腺癌组织标本作实验组,21例乳腺良性疾病组织和145例正常人血液标本作正常对照.全部标本以酚-氯仿抽提法提取DNA 后经PCR扩增CHEK2基因外显子1、10、11、13、14,并分别对PCR扩增产物进行SSCP分析,然后对出现泳动变位或异常区带者进行DNA测序,后与基因库序列对比分析其突变情况.结果 65例乳腺癌共检测出4例突变, 1例为外显子10缺失所致框移突变(1100del C),3例为外显子11的插入所致框移突变(1336ins G);145例正常人检测出1例突变,为外显子1的错义突变(252A>G);21例良性疾病患者未发现突变.所有检测对象未发现CHEK2基因外显子13、14有突变.乳腺癌组CHEK2基因突变率为6.15%(4/65),与对照组比较(0.6%,1/166)差别具有显著性(P<0.05).结论 CHEK2基因突变与乳腺癌发生有一定关系,可能在乳腺癌的发生发展过程中起重要作用.
关键词： 乳腺癌 细胞周期调定点激酶基因 SSCP DNA序列分析 -
耐喹诺酮类大肠埃希菌耐药机制的研究
目的 探讨耐喹诺酮类大肠埃希菌的耐药机制.方法 收集天津市第一中心医院2004年3月-2005年10月临床分离的大肠埃希菌,并随机选取40株作为研究对象,通过K-B药片试纸法和微量稀释法测40株目的菌株的耐药性;PCR扩增耐药株的gyrA QRDR区和parC基因,进行PCR-SSCP分析;同时,PCR扩增marOR基因,在耐药株中随机选取进行测序,检测marOR基因突变情况.结果 37株对耐喹诺酮类菌株均出现了gyrA基因突变,除常见氨基酸改变外,还发现Asp87→Asn、Ala84→Pro;36株耐喹诺酮菌株发生了parC基因突变,只对萘啶酸耐药,对环丙沙星中介、氧氟沙星、加替沙星敏感的ECO24未出现parC基因突变;只对氟喹诺酮类耐药的ECO11未出现marOR区突变;存在多重耐药的ECO5 marOR区发现6处突变,且1 879 bp处的突变改变了marOR的终止密码子.结论 gyrA和parC基因突变引起大肠埃希菌产生耐药,gyrA基因突变是产生对氟喹诺酮类耐药的主要原因,parC 基因突变可引起菌株对氟喹诺酮类药物的高水平耐药,marOR的多位点突变在多重耐药机制中有一定的作用.
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临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌gyrA基因突变的研究
目的:检测临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌DNA促旋酶gyrA基因突变情况.方法:收集临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌30株及敏感株10株,测定其对萘啶酸、环丙沙星、氧氟沙星的低抑菌浓度(MIC);用聚合酶链反应(PCR)扩增gyrA基因部分片断,对PCR产物进行限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)及单链构象多态性(PCR-SSCP)分析,检测gyrA突变情况.结果:30株耐喹诺酮菌株都检测到gyrA基因突变,PCR-RFLP均显示两条不同于敏感株的电泳带,其PCR-SSCP则检测到4种不同于敏感菌的迁徙率条带;而10株敏感菌均未检测到gyrA基因突变.结论:阴沟肠杆菌对喹诺酮类药物耐药性与gyrA基因突变有关,gyrA基因第83位氨基酸密码子突变可能为其耐药的主要原因.
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耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用
目的:探讨耐多药结核病(MDR-TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值.方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析了同时54株耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和45株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变.结果:以结核分支杆菌H37RV为对照,45株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常,其特异性为100%;KatG基因有2株图谱异常,特异性为96.3%.89株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失,其PCR扩增产物SSCP分析结果表明:54株多耐药临床分离株中,49株rPOB基因图谱异常;32株KatG基因图谱异常;40株rpsL基因图谱异常.其敏感性分别为rPOB(90.7%)、KatG(59.3%),rpsL(74.1%).结论:结核分枝杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致.PCR-SSCP技术有望成为结核分枝杆菌耐药性检测的方法之一.
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宫颈癌患者核糖核酸酶抑制因子基因突变的分析
目的 通过对宫颈癌患者血液核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因RNH的突变分析,探讨RNH基因与肿瘤生长的关系.方法 针对RNH全基因序列设计21对引物,PCR扩增后采用SSCP对突变进行检测.结果 正常人和宫颈癌患者均扩增出相应的21个条带,未发现异常;经过SSCP分析未发现所收集的18例宫颈癌患者血液中的RNH基因有突变发生.结论 尚不能肯定RNH基因的突变是否与肿瘤无关,也不能肯定其他肿瘤没有发生突变.需缩小检测片段进一步实验.
关键词： 核糖核酸酶抑制因子基因 PCR SSCP 基因突变 -
聚合酶链反应-单链构型多态性检测细胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因变异
目的:检测与分析淋病奈瑟菌L型的cppB基因,探讨细胞壁缺陷对淋病奈瑟菌cppB基因的影响.方法:用青霉素诱导淋病奈瑟菌成为L型并获得稳定L型纯培养物,用cppB基因特异性引物以聚合酶链反应(PCR)检测稳定L型纯培养物的cppB基因和进行单链构型多态性(SSCP)分析.结果:淋病奈瑟菌的细菌型及其L型都具有cppB基因扩增产物,但PCR-SSCP分析可见异常泳动DNA带型(细菌型有2条带、L型有3条带).结论:细胞壁缺陷淋病奈瑟菌仍然具有cppB基因,但其碱基序列可以发生改变.
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类风湿关节炎小鼠关节浸润的T细胞克隆型分析
目的:对一种自发性类风湿关节炎(RA)小鼠(SKG小鼠)四肢足关节浸润的T细胞克隆型进行分析,以了解T细胞克隆型与RA的关系.方法:采用RT-PCR与单链构象多态性分析( SSCP)相结合的方法.结果:在SKG小鼠的四肢足关节Vβ2和Vβ8.2 T细胞克隆型的一致率比较高(分别为68.1%和59.2%),并且在被检测的所有小鼠的四肢足关节中都具有一致的Vβ2和 Vβ8.2克隆型 (100%).DNA测序表明在SSCP中显示的来源于不同关节样品的共同的DNA带是相同的T细胞克隆型.T细胞转移试验表明关节聚集的T细胞克隆与RA的病变形成有关.结论: TCR为Vβ2和Vβ8.2的T细胞可能在SKG小鼠的RA中具有重要作用.
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耐多药结核分支杆菌基因突变在老年结核病病人耐药性检测中的应用
目的 探讨耐多药结核病(MDR-TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在结核病耐药性检测中的应用价值.方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析了同时耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和35株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变.结果 以结核分支杆菌H37RV为对照,35株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常,其特异性为100%;KatG基因有2株图谱异常,特异性为94.3%.71株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失,其PCR扩增产物SSCP分析结果表明:36株多耐药临床分离株中,32株rPOB基因图谱异常;21株KatG基因图谱异常;26株rpsL基因图谱异常.其敏感性分别为rPOB(88.9%)、KatG(58.3%),rpsL(72.2%).结论 结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致.PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一.
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PCR-SSCP分析方法的优化
目的:优化PCR-SSCP分析方法.方法:选择野生型Kir2.3质粒和突变型Kir2.3(I2123L)质粒为样本,其PCR结果的鉴定采用2%的琼脂糖凝胶EB显色,SSCP分析采用12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶DNA银染显色.PCR产物变性比较了三种方法:即碱变性、SDS变性、直接变性.聚丙烯酰胺凝胶根据丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺及甘油的比例设计了六个实验组,每组采用两种条件电泳,即:30mA恒流快速电泳和100V恒流过夜电泳.结果:选择直接变性的PCR产物作为变性上样液,并确定了三种凝胶配及该条件下适用的电泳条件.即:丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为49比1,凝胶中含1%甘油,4℃,500V高压电泳3min接着30mA恒流快速电泳3h;丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为49比1,凝胶中含5%甘油,4℃,500V高压电泳3min接着30mA恒流快速电泳3h;丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为29比1,凝胶中不舍甘油,4℃,500V高压电泳3min接着100V恒流过夜电泳12h.结论:条件优化的PCR-SSCP是一种筛查基因突变简便、有效的实验方法.
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胃癌中DNA 聚合酶β的突变及与幽门螺杆菌感染的关系
目的:研究胃癌组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况及与幽门螺杆菌感染的关系.方法:提取总RNA反转录合成cDNA,经PCR扩增后以SSCP检测其变异情况.用PCR方法检测胃癌及癌旁组织标本中幽门螺杆菌的感染情况.结果:32例胃癌组织标本中有7例polβ-SSCP异常,突变率为21.9%;而对应的32例癌旁组织PCR-SSCP结果中未见异常.H.Pylori-DNA阳性的15例,H.Pylori-DNA阳性率为46.9%(15/32);对应癌旁组织的检测结果与胃癌组织完全一致.polβ SSCP阳性的标本H. Pylori-DNA也阳性.结论:胃癌组织存在polβ基因突变;这种基因突变可能与胃癌的发生、发展相关.幽门螺杆菌的感染与胃癌组织polβ突变可能存在一定的相关关系.
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斑马鱼分子遗传位标及多态性研究进展
过去二十年间,分子遗传位标可揭示DNA水平的多态性,在斑马鱼的遗传研究中所占比重越来越大.本文介绍分子遗传位标及斑马鱼遗传图谱,探讨这些遗传位标使用时的优缺点,展示斑马鱼品系的多态性.
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应用巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP对山东肾综合征出血热病人血清中HV基因检测和分型研究
目的探讨山东肾综合征出血热重疫区病人血清中HV分子生物学特征,同时寻找准确、简便、迅速的HV检测与分型方法,从而为制定防治决策提供科学根据.方法从山东肾综合征出血热重疫区临沂市费县收集病人早期血清,应用巢式RT-PCR对病人血清中的HV进行基因扩增,采用RFLP、SSCP分型,并进行序列测定与分析.结果 48份临床和ELISA检测确诊的HFRS病人血清经巢式RT-PCR扩增后,41份阳性,阳性率85.42%.41份阳性标本巢式RT-PCR产物经Hind Ⅲ、HinfⅠ酶切后,呈现2种不同的RFLP图谱:33份显示与R22株相似的酶切图谱,应属SEOV型;另外8份显示出与HTN 76-118株相似的图谱,属HTNV型,这8份HTNV型标本均为10-12月间收集的病人血清.41份阳性标本巢式RT-PCR产物经SSCP分析,亦呈现2种不同的图谱:33份具有与R22株相似的SSCP图谱,应属SEOV型;而另8份则与HTN 76-118株具有相似的SSCP图谱,属HTNV型.对部分扩增产物序列采用系统进化树分析也得出类似的结果:sdp1、sdp2、sdp3与HTN型76-118株亲缘关系相近,属同一簇,而sdp22、sdp37与SEOV型Z37、R22株亲缘关系相近,属另外一簇,这与RFLP和SSCP获得的结果相一致.结论山东肾综合征出血热重疫区病人基因型以SEOV型为主,但在秋冬季节也存在HTNV型.巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP法可对HV准确分型,而且简便、迅速,适合于大规模流行病学调查.
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高效毛细管电泳-单链构象多态性分析K-ras基因突变
Lung cancer is one of the most prevalent cancers and the leading cause of cancer mortality in the world. It is of great importance to study mutation of gene related to lung cancer. Mutations in cellular ras gene have been strongly implicated in various stages of mammalian tumorigenesis. In human tumors, the point mutations which have been identified have largely been localized to codon 12,13 or 61 of three ras genes : H-ras, K-ras and N-ras.
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单链构象多态性分析K-ras和p16基因突变
目的:研究大鼠肺癌组织K-ras和p16 基因突变情况. 方法: 运用聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR-SSCP) 技术分析肺癌组织K-ras和p16 基因突变.结果:未发现正常大鼠肺组织中K-ras和p16 基因突变, 在肿瘤组织中 K-ras和p16均有2例突变发生.结论: K-ras和p16 基因突变与肺癌发生存在一定的相关性.
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毛细管电泳PCR-SSCP分析p16基因突变
Lung cancer is one of the most common cancers in the world. Some genetic alterations such as p53 gene and ras gene mutations, have been identified in this disease. Recently, a putative tumor suppressor gene, the p16/CDKN2/MTS1 gene containing 3 extrons and 2 introns, located in the chromosome p21 region, was cloned independently by three research groups. Traditionally, gene mutation analysis was performed by slab polyacrylamide gel electrophoresis. However, this method is laborious, time-consuming, low sensitivity and harmful to human health. Capillary electrophoresis (CE) with the characteristics of rapidity and high performance has numerous advantages over conventional slab polyacrylamide gel electrophoresis. An important advantage of CE is that the commercially available system is automation.
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食管癌中DNA聚合酶β的突变
目的研究DNA聚合酶β基因在采自食管癌高发区的食管癌标本中的突变情况.方法提取总RNA反转录合成cDNA,经PCR扩增后以SSCP检测其变异情况.结果在食管癌组织标本中存在pol β基因的突变:20例癌组织标本中发现9例突变(45%、9/20),癌旁组织中发现1例突变(5%、1/20).结论在食管癌组织标本中确实存在pol β基因的突变,推测在食管癌的的发生发展过程中pol β基因突变是一个始动因素,是各种致癌因子作用的枢纽,由于该基因的突变可能使得癌基因、抑癌基因如:ras、p53、Rb等的原发性损伤得不到及时正确修复,导致细胞周期的失控、增殖过多,促进恶性转化.
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粪便中p53与APC突变检测在大肠癌诊断中的意义
目的探讨在大肠癌患者粪便中检测p53、APC基因突变的可行性及其应用前景和意义.方法从36例大肠癌患者、10例大肠腺瘤患者以及30例正常对照者的粪便中分别提取DNA,应用PCR-SSCP法检测粪便中p53、APC基因突变情况.结果 36例大肠癌患者粪便中p53及/或APC基因突变检出率为77.78%(19/36),二者突变率分别为52.78%(19/36)和36.11%(13/36);10例大肠腺瘤中p53基因突变检出率为0%,APC为20%;30例正常对照粪便中p53、APC基因突变检出率均为0%.p53的突变随大肠癌分化程度的降低而增高(P＜0.05);APC基因突变与大肠癌组织学类型无关(P＞0.05).结论联合检测粪便中p53与APC突变在大肠癌诊断和筛查中有潜在的应用价值.
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乳腺癌BRCA1基因突变的筛查研究
目的研究BRCA1基因在散发性乳腺癌中的突变情况,探讨BRCA1基因突变与乳腺癌的关系.方法应用PCP-SSCP(single-strand conformation polymorphism analysis)分析和DNA直接测序法,检测65例散发性乳腺癌BRCA1第2,3,5,8,10,12,13,14,15,16,17,18,19,20和21外显子基因突变情况.结果65例中共检测出4例突变,其中1例为5外显子的错义突变(287 A＞T),1例为12外显子的错义突变(4 285 G＞A),1例为17外显子的错义突变(5 115 T＞C),1例为18外显子的错义突变(5 206 T＞A).乳腺癌BRCA1的基因突变率为6.2%(4/65).结论BRCA1基因突变与散发性乳腺癌有密切关系.
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糖尿病合并肺结核患者耐多药结核分枝杆菌基因突变的检测
目的: 探讨耐多药结核分枝杆茵,临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在糖尿病合并肺结核患者耐药性检测中的应用价值.方法: 采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对41株自糖尿病合并肺结核患者痰液中培养分离的同时耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和46株对RFP、INH、SM敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变状况.结果: 46株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因SSCP图谱正常,特异性为100%.PCR扩增产物SSCP分析结果显示:41株多耐药临床分离株中,36株rPOB基因图谱异常,26株KatG基因图谱异常,29株rpsL基因图谱异常,检测敏感性分别为rPOB(87.8%)、KatG(63.4%),rpsL(70.7%).结论: 结核分枝杆菌对RFP、INH、SM产生耐药性的机制主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致.
