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应用自制微切割工具切割石蜡组织行PCR-银染
微切割技术是通过显微操作系统对欲选取的材料(组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等)进行切割分离并收集用于后续研究的技术.该方法尽可能地排除了背景细胞的干扰,大大提高了分子生物学检测手段的精确度[1].近年来,微切割-PCR-银染技术在肿瘤发病机制研究中的应用越来越多,但是目前从石蜡包埋组织中提取基因组DNA还有一定难度,在数量和质量上都不能令人满意[2].国外也有多种微切割-PCR技术的报导,但多以激光捕获微切割(LCM)为主[3],仪器设备昂贵,推广较困难.我们长期摸索在石蜡切片中用自制工具行微切割-DNA提取-PCR-银染的技术,总结出一套较高效、经济、稳定的技术方法.
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癌细胞原位研究进展
癌细胞原位分析有助于了解肿瘤发生发展过程中相关的基因、蛋白和信号分子等改变,可促进较精确的诊断方法、靶基因疗法以及肿瘤特异性标记物的发现.重点就癌细胞原位研究相关的一些新技术进展,如微切割、基因组学、遗传学和蛋白组学等技术,及其应用作一简要回顾,并对21世纪肿瘤分子生物学研究前景进行展望.
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蛋白和基因水平探索H/RS细胞的起源
目的从蛋白、组织和单细胞的基因水平进一步探索H/RS细胞的来源及其克隆性.方法首先对33例经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)标本进行B细胞特异性激活蛋白(BSAP)和CD20的检测,然后对33例cHL患者的石蜡刮片组织和部分阳性病例的微切割细胞进行免疫球蛋白重链基因克隆性重排检测,并对同一病例的石蜡刮片组织和微切割细胞的扩增产物进行测序分析比较.结果 33例中30例的H/RS细胞表达BSAP,10例表达CD20,BSAP和CD20的表达率差异有显著性(P=0.000),对照病例中反应性增生淋巴结的B淋巴细胞和B细胞淋巴瘤肿瘤细胞的BSAP和CD20表达均为100%,T细胞淋巴瘤的肿瘤细胞无表达;33例中的16例石蜡刮片组织IgH基因重排阳性,微切割的19管H/RS细胞有14管出现重排阳性,细胞数目不同的各管阳性率差异无显著性(P=0.280);同一病例的石蜡刮片组织和微切割细胞的PCR产物测序结果均为IgH可变区片段,但是碱基序列并不完全相同.结论进一步支持cHL中大多数H/RS细胞为B细胞起源,且可能来源于其不同的分化阶段.
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非小细胞肺癌微切割组织中3p杂合性丢失的研究
目的:探讨微切割非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中3p14.2和3p25等位基因的杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)与NSCLC发生发展之间的相关性.方法:采用微切割技术和聚合酶链反应(PCR)结合二核苷酸(CA)n重复序列多态性方法,分析44例NSCLC石蜡切片中癌组织和非癌组织中3p14.2和3p25位点的杂合性丢失(LOH).结果:在44例NSCLC中29例组织标本检测3p14.2位点的LOH,其丢失率为65.5%(19/29),而另外15例患者中3p25的LOH的丢失率为40.0%(6/15).微切割的非癌组织均未见有3p的丢失,癌组织的3p LOH频率与肺癌组织学分类及TNM分期均无明显关系(P＞0.05).结论:NSCLC癌组织中普遍出现3p14.2及3p25杂合性丢失现象,从而提示该两处可能存在一个或多个与人体肺细胞癌变相关的抑癌基因.
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在石蜡切片中进行微切割-PCR-银染的方法
目的 探索在石蜡切片中应用微切割-PCR-银染技术,检测大肠癌的微卫星不稳定性和杂合性缺失.方法 用微切割技术在28例石蜡切片中提取淋巴细胞和间质细胞、癌旁粘膜腺管、不典型增生腺管、腺瘤腺管和腺癌细胞,每例至少包含3种类型细胞,经蛋白酶K消化后,直接用于PCR扩增,产物进行8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染.共进行了TGF-βRⅡ(A)10、hMSH2(A)26-Bat26,hMSH3(A)8,hMSH6(C)8 4个微卫星位点的检测.结果 hMSH3(A)8和hMSH6(C)8位点在28例标本全部扩增出目的片段,而TGF-βRⅡ(A)10和hMSH2(A)26位点则分别有23例、22例扩增出目的片段,且hMSH2(A)26位点有5例癌细胞呈阳性,其中1例同时有腺瘤细胞阳性.结论 微切割-PCR-银染技术应用于石蜡切片,可获得较满意的结果,可用于检测微卫星不稳定性等研究.
