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利用THP-1细胞进行致敏物鉴定的方法验证
目的 探讨建立以THP-1源性巨噬细胞为受试细胞,以细胞上清液中细胞因子表达改变为检测指标的体外检测化学物致敏性的试验方法.方法 将人单核细胞株THP-1细胞用佛波酯(PMA,0.1μg/ml)诱导,使之转化为具有贴壁能力的THP-1巨噬细胞.选择5种已知的化学致敏物硫酸镍(NiSO4)、2,4-二硝基氯代苯(DNCB)、苯二胺(PPDA)、重铬酸钾(K2Cr2O7)、异氰酸酯(TDI)和2种非化学致敏物十二烷基磺酸钠(SDS)、异丙醇(IPA)为受试物,检测不同浓度受试物处理细胞的不同时间点时细胞因子表达的变化.分别用ELISA法检测细胞培养上清IL-6、TNF-α的水平,用流式液相多重蛋白定量技术(CBA)检测IL-1β、IL-8细胞因子的表达水平.结果 NiSO4、DNCB和K2Cr2O7作用6h,PPDA、TDI作用12h时,THP-1细胞上清中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8四种细胞因子的表达量高.5种化学致敏物NiSO4、DNCB、K2Cr2O7、PPDA和TDI在适时间点适浓度刺激细胞分泌IL-6的水平分别为对照组的40、25、20、50和50倍,TNF-α水平为对照组的20、12、20、8和5倍,IL-1β水平为对照组的30、60、25、30和45倍,IL-8水平为对照组的15、12、15、12和7倍;非致敏物SDS与IPA处理组IL-6水平均有升高,其中SDS组升高明显,约为空白对照组的20倍.TNF-α、IL-1 β和IL-8表达水平无明显变化.结论 利用THP-1巨噬细胞检测细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8表达水平的试验方法可以有效区分化学致敏物与非致敏物,因此这3个指标可作为鉴别化学致敏物和非致敏物的有效参考指标.
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内毒素刺激时人单核细胞白血病细胞中髓系细胞触发受体1表达的实验研究
目的:了解内毒素刺激时,髓系细胞触发受体1(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1,TREM-1)在核酸和蛋白质水平的表达及其意义.方法:将无血清培养基培养的THP-1细胞随机分为4组(A、B、C、D).A为空白对照,B、C、D三组分别用100、100、100 ng/ml脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)及40、10、0μM的核因子-κB(Nuclear Factor,NF-κB)阻断剂四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(Pyrrolidine Dithiocarbamate,PDTC)作用12 h后,提取RNA及总蛋白.用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TREM-1 mRNA的表达,用Western Blotting检测TREM-1蛋白的表达,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素1 β(IL-1β),白细胞介素10(IL-10)水平.结果:A、B、C、D各组Trem-1 mRNA/β-actin及TREM-1蛋白/GAPDH比值依次增加,组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论:内毒素刺激时TREM-1的表达受到NF-κB的影响,并在脓毒症早期起重要作用.
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P38MAPK信号转导通路在大蒜素诱导THP-1细胞凋亡中的作用
目的:探讨大蒜素诱导THP-1细胞凋亡中P38MAPK及Fas基因表达的变化.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度大蒜素对THP-1细胞增殖抑制率;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术(FCM)检测凋亡率的变化;免疫细胞化学法观察大蒜素处理后细胞内磷酸化P38MAPK(P-p38MAPK)表达及分布变化;Western blot检测大蒜素处理前后细胞内P-p38MAPK和Fas蛋白表达量的变化.结果:MTT显示大蒜素能抑制THP-1细胞增殖,并呈时间-剂量依赖性.其72h中效浓度(IC_(50))为12.8 mg·L~(-1).Annexin V-FITC/PI检测凋亡率随大蒜素浓度增加而增加.免疫细胞化学法检测药物处理后P-p38MAPK表达增加,主要分布于细胞核与细胞浆,而阴性对照组仅弱表达.Western blot结果分析P-p38MAPK,Fas蛋白表达量随大蒜素浓度的增加而增加,呈剂量依赖性.其阴性组、72 h的1/2 IC_(50)组、IC_(50)组P-p38MAPK蛋白表达水平(相对灰度值)分别为0.259 8±0.013 2,0.361 2±0.008 3,0.505 6±0.005 5;Fas蛋白表达水平分别为0.287 4±0.008 9,0.426 8±0.007 9和0.597 1±0.010 9,差别均有显著性意义(P<0.01).结论:大蒜素可诱导THP-1细胞凋亡,其诱导凋亡机制可能是通过激活P-p38MAPK/Fas途径实现.
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调补肺肾三法对香烟烟雾提取物和脂多糖刺激单核巨噬细胞THP-1分泌细胞因子的影响
目的 探讨调补肺肾三法治疗慢性阻塞性肺疾病的分子机理. 方法 用香烟烟雾提取物(CSE)和脂多糖(LPS)及两者联合(LC)体外刺激单核巨噬细胞THP-1,每种刺激物下分为正常组(加入20％正常大鼠血清)、刺激物组(加入20％正常大鼠血清和5％CSE,或75pg/ml LPS,或5％CSE和75pg/ml LPS)、补肺益肾组、补肺健脾组和益气滋肾组(加20％相应方药大鼠含药血清和5％CSE,或75pg/ml LPS,或5％CSE和75pg/ml LPS),检测各组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-3(IL 3)、巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、转化生长因子-β(TGF-β)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、CD36、磷脂酸磷酸酶2B(PPAP2B),应用网络工具分析细胞因子的转录因子.结果 与正常组比较,CSE组、LPS组和LC组分泌MMP-9增加,分泌TNF-α和PPAP2B减少；CSE组分泌TIMP-1减少,LPS组分泌TGF-β增加,LC组GM-CSF分泌增加(P＜0.05或P＜0.01).3个复方对细胞分泌的各因子调节明显不同(P＜0.05或P＜0.01),其中补益肺肾方在各条件下,所调节分泌的因子和涉及转录因子较为广泛. 结论 CSE和LPS对THP-1分泌细胞因子影响不同,调补肺肾三法在一定程度上都对CSE和LPS刺激下分泌细胞因子有调控作用,补益肺肾方药作用明显而广泛,补肺健脾方次之.
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熊果酸对THP-1细胞HMGB1表达和NF-kB活性的影响
目的 研究熊果酸(UA)对人单核细胞系THP-1细胞HMGB1表达和NF-kB活性的影响.方法 用不同浓度的UA(0、0.1、1、5和10 μmol/L)作用细胞后进行如下检测:1)MTr检测细胞增殖;2)RT-PCR法检测HMGB1和P65 mRNA表达;3)Western blot检测HMGB1和P65蛋白的表达;4)荧光素酶报告基因转染,质粒pNF-kB-luc瞬时转染THP-1细胞,转染40h后加1μmol/L UA作用,于转染48 h后进行荧光素酶活性测定.结果 1)随着UA浓度的增高,可明显抑制THP-1细胞的增殖;2)不同浓度的UA对THP-1细胞HMGBl mRNA和蛋白表达,呈现出一定的双向性,且以l μmol/L UA作用强(P ＜0.05);3)UA可增强P65 mRNA和蛋白表达以及NF-kB活性.结论 UA可影响单核细胞HMGB1表达和NF-kB活性.
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熊果酸减轻LPS诱导的THP-1细胞损伤
目的 探讨熊果酸减轻脂多糖诱导的THP-1细胞损伤的作用及其机制.方法 以脂多糖诱导的THP-1炎性细胞为模型,MTT法检测不同浓度的熊果酸(0.1、1、5、10、20、40和80 μmol/L)对细胞增殖的影响,RT-PCR法检测TLR4、MCP-1和IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测MCP-1和IL-6表达,Western blot法检测P65、磷酸化P65蛋白表达,荧光素酶报告系统检测核转录因子κB (NF-κB)活性.结果 与对照组比较,LPS作用组能显著增高MCP-1、TLR4、IL-6 mRNA和MCP-1、IL-6、P65、磷酸化P65蛋白的表达并上调NF-κB活性(P＜0.05);与LPS单独作用组比较,熊果酸(1和5μmol/L)干预组能够显著降低MCP-1、TLR4、IL-6mRNA和MCP-1、IL-6表达水平并下调NF-κB活性(P＜0.05).结论 熊果酸可能是通过下调NF-κB活化减轻脂多糖诱导的THP-1细胞的损伤.
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Livin在白血病耐药细胞系THP-1R的表达
Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族新成员,在正常组织极少表达,而在多数恶性肿瘤组织细胞中高表达,与肿瘤抗凋亡和耐药性有关[1].为探讨Livin与白血病细胞耐药的相关性,本实验主要从分子水平研究Livin在人急性白血病细胞系THP-1与耐药细胞系THP-1R中的差异表达情况,为Livin在白血病多药耐药( multi-drug resistance,MDR)方面的意义提供实验依据.1材料与方法1.1材料主要试剂:RPMI 1640培养液(Promega公司);兔抗Livin抗体(博奥森生物技术有限公司);引物(上海生工生物工程公司);RT-PCR试剂盒(MBIFermentas公司);双链siRNA和RNAi-Mate转染试剂(上海吉玛生物技术公司).1.2方法1.2.1细胞培养:THP-1细胞为本室冻存,用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5％ CO2条件下培养,2～3d传代1次.采用逐渐增加药物浓度的方法[2]建立THP-1耐Ara-C的耐药系THP-1R,实验前2周撤去药物,以正常的RPM1640培养液培养,然后取对数生长期细胞用于后继实验.1.2.2 siRNA转染:参考文献[1],针对人Livin基因2个异构体的共同部分合成siRNA序列,正义链5’-GACAGUGCC AAGUGCCUGCdTdT-3’,反义链5'-GCAGGCACUUGGCACUG UCdTdT-3’.按照说明书所述比例配制siRNA/RNA-Mate复合物和完全培养基的混合液,用此混合液稀释细胞至所需浓度,再分配到培养板各孔.非转染对照组用生理盐水代替siRNA.同时转染有荧光标记的阴性对照siRNA,在荧光显微镜下观察和判断转染效果.
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沉默DOT1L基因对急性单核细胞白血病细胞THP-1增殖的影响
本研究旨在探讨DOT1L基因对人白血病THP-1细胞增殖的影响.针对DOT1L mRNA的第732-752靶位点设计并合成shRNA,构建pLKO-Tet-On条件性干扰载体,制备慢病毒并感染THP-1细胞,用强力霉素(Dox)诱导干扰载体表达;应用RT-PCR的方法验证干扰效率;采用改良MTT法检测干扰DOT1L基因后对THP-1细胞增殖能力的影响;用细胞集落形成实验观察干扰后细胞集落形成的能力;用流式细胞术分析细胞周期的变化.结果表明:THP-1细胞干扰后DOT1L基因的表达显著降低;DOT1L基因的表达下调抑制了细胞的增殖能力、集落形成能力并将细胞周期阻滞在G0/G1期.结论:利用shRNA靶向干扰DOT1L基因的表达,可以有效抑制人急性单核细胞白血病细胞THP-1的增殖.
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二甲双胍对急性单核细胞白血病细胞株THP-1增殖、分化和凋亡的影响
目的:探讨二甲双胍(metformin)对体外培养的急性单核细胞白血病细胞株THP-1细胞增殖、分化和凋亡的影响,并分析其可能的作用机制.方法:用不同浓度的二甲双胍分别对THP-1细胞进行体外干预,24h、48 h后用CCK-8法检测细胞的增殖情况;20 mmol/L二甲双胍干预24h后用AnnexinV/7-AAD双标记法分析细胞凋亡情况;流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b、CD14的变化;实时定量PCR检测BCL-XL、BAX、BIM、Caspase-3mRNA表达的变化.结果:CCK-8法检测显示二甲双胍对THP-1细胞增殖具有显著的抑制作用,且作用呈时间和剂量依赖性;20 mmol/L二甲双胍干预THP-1细胞24 h后,流式细胞术检测结果显示CD11b、CD14阳性细胞率无明显变化(P＞0.05);AnnexinV/7-AAD标记的流式细胞术检测显示,实验组和对照组早期凋亡细胞比例分别为(2.02±0.85)％和(4.46±1.33)％,晚期凋亡细胞比例分别为(1.43±0.83)％和(3.31±0.59)％,在实验组明显高于对照组(P＜0.05);20 mmol/L二甲双胍诱导THP-1细胞过程中BCL-XL、BIM表达无明显变化,BAX、Caspase-3表达显著增加(P＜0.01).结论:二甲双胍能有效抑制THP-1细胞增殖并促进细胞凋亡,但对THP-1细胞分化无明显影响,其促进凋亡机制可能与上调BAX及Caspase-3基因有关.
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抑制miR-155表达对白血病细胞系THP-1的增殖和凋亡影响及作用机制
本研究通过转染miR-155抑制物(inhibitor)下调THP-1细胞的miR-155表达,探讨抑制miR-155表达对THP-1细胞增殖及凋亡的影响及其机制.通过X-treme GENE siRNA Transfection Reagent在THP-1细胞转染miR-155 inhibitor(THP-1I),同时设置未转染组(THP-1C)和转染对照组(THP-1 IC);应用实时定量PCR (RT-PCR)检测miR-155转染效率及转染后SHIP1的mRNA基因水平的表达,应用CCK-8法检测对细胞系增殖的影响,流式细胞术检测对凋亡的影响,Western blot法检测转染后的SHIP1、AKT、pAKT蛋白水平的基因表达.结果表明,与THP-1C和THP-1IC相比,THP-1I的miR-155表达水平明显降低(P＜0.05);抑制miR-155可导致THP-1细胞的凋亡率明显增高(P＜0.05);抑制miR-155对THP-1细胞的SHIP1 mRNA含量无明显影响,但导致SHIP1蛋白水平明显升高(P＜0.05),提示miR-155对THP-1细胞的SHIP1可能存在翻译水平的调节;miR-155抑制尽管未导致总AKT(TAKT)的蛋白含量变化,但pAKT蛋白水平明显降低(P＜0.05).结论:抑制miR-155表达可能通过增加SHIP1蛋白含量和抑制PBK/AKT信号途径促进THP-1细胞凋亡,提示抑制miR-155可能成为抗白血病治疗的新策略.
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马钱子碱诱导人单核细胞白血病THP-1细胞凋亡及作用机制
本研究旨在探讨马钱子碱对人单核细胞白血病THP-1细胞的诱导凋亡作用及其可能的作用机制.应用CCK-8法检测马钱子碱对THP-1细胞的生长抑制作用;应用AO/EB荧光染色法、Annexin-V/PI双染法检测马钱子碱对THP-1细胞凋亡的影响;PI单染法检测马钱子碱对THP-1细胞周期的影响;RT-PCR检测BCL-2、BAX基因的表达.结果表明,马钱子碱能有效地抑制THP-1细胞的生长,呈剂量和时间依赖关系;THP-1细胞经浓度为400μg/ml马钱子碱作用48 h后,大部分细胞核染色质被EB染成橘红色并呈固缩状,显示为晚期凋亡的细胞形态;0-400 μg/ml范围内的马钱子碱作用THP-1细胞48 h后,随着药物浓度的增高,细胞凋亡率逐渐上升;与对照组相比细胞周期被阻滞于G0/G1期,并出现亚二倍体凋亡峰;RT-PCR结果显示,BCL-2基因表达明显下降,BA基因表达上调.结论:马钱子碱能抑制THP-1细胞生长,诱导其凋亡,并对细胞周期起阻滞作用,其作用机制可能与BCL-2基因表达抑制及BAX基因表达激活有关.
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青蒿琥酯通过诱导凋亡发挥抗THP-1细胞增殖作用
目的:了解青蒿琥酯(artesunate,ART)是否能抑制THP-1细胞的增殖,并探讨其相关的抗白血病的作用机制.方法:分别用5种浓度的青蒿琥酯处理THP-1细胞24、48和72 h,采用CCK-8法检测细胞的活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot方法检测STAT3、Caspase3和Caspase8蛋白表达水平的变化.结果:与对照组相比,ART能明显抑制THP-1细胞的增殖,其效应呈剂量依赖性(r=0.9829,P＜0.05);流式细胞术实验结果表明,ART能显著增加THP-1细胞的凋亡,且ART处理THP-1细胞后STAT3蛋白表达显著下降(P＜0.01),同时Caspase3及裂解的Caspase3和Caspase8表达均增加(P＜0.01).结论:青蒿琥酯能抑制THP-1细胞的生长,可能与下调STAT3蛋白的表达,并同时激活Capase3和Caspase8有关.
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水合淫羊藿素对THP-1细胞增殖和凋亡的影响及机制研究
目的:探讨水合淫羊藿素(icaritin)对THP-1细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制.方法:用MTS法、流式细胞术和Hoechst 33258荧光染色检测icaritin对THP-1细胞的增殖抑制及促凋亡作用,Western blot技术检测BCL-2、BAX和Caspase-3蛋白的表达.结果:4-32 μmol/L icaritin作用24-72 h对THP-1细胞有增殖抑制作用(P＜0.05),且呈时间-剂量依赖关系(r=0.946);4-32 μmol/L icaritin作用24和48 h,对THP-1细胞有凋亡诱导作用(P＜0.05),也显示时间-剂量依赖关系(r=0.924).icaritin作用THP-1细胞48 h后,THP-1细胞BCL-2蛋白的表达较对照组显著降低(P＜0.05),而BAX和Caspase-3表达较对照组显著增高(P＜0.05).结论:Icaritin对THP-1细胞有增殖抑制及促凋亡作用,icaritin可能通过线粒体途径诱导THP-1细胞的凋亡.
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CCL2通过白血病细胞THP-1自分泌多种炎性趋化因子调控其迁移和侵袭
目的:探讨细胞因子CC配体2(CCL-2)对急性白血病细胞THP-1迁移和侵袭的影响及机制.方法:采用慢病毒包装的方法将表达质粒PLVX-CCL2转染THP-1细胞,用RT-PCR检测CCL-2 RNA水平的表达,Western blot及ELISA法验证蛋白水平的变化,应用Transwell迁移和侵袭实验方法分别检测CCL2重组蛋白及THP-1自身高表达CCL2对THP-1细胞迁移和侵袭能力的影响,应用迁移相关细胞因子的PCR array法探讨可能的机制.结果:RT-PCR和Western blot方法证实成功构建过表达CCL2的THP-1-CCL2细胞.ELISA法检测显示,THP-1-CCL2培养上清中CCL2蛋白水平显著增高;高表达CCL2的转染组细胞在Trans-Matrigel实验中,其上室CCL2蛋白浓度显著高于下室(P＜0.001),同时穿膜能力下降,但迁移能力没有明显改变,与对照组比较,分别为(1.702±0.537 vs0.520±0.255)(P=0.026)和(9.293±0.302 vs 9.187±0.526) (P=0.77),增加Trans-Matrigel下室的CCL2浓度,可以增强THP-1细胞的迁移能力和侵袭能力.迁移RT2 profiler PCR array显示,CCL2重组蛋白处理THP-1细胞后,与对照组相比CCL2、EPX、SPP1、CX3CL1和CXCL13的表达上调(＞2倍).结论:CCL2通过白血病细胞THP-1的自分泌多种炎性趋化因子而调控其迁移和侵袭.
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CXCR7在急性单核细胞白血病中的表达及对THP-1细胞功能的影响
目的:探讨基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)受体CXCR7在急性单核细胞白血病(AML-M5)中的表达,及其对急性单核细胞白血病细胞系THP-1增殖、凋亡和侵袭能力的影响.方法:应用流式细胞术、Western blot、RT-PCR分别检测初诊AML-M5患者和正常人外周血单个核细胞(PBMNC)及THP-1细胞CXCR7蛋白和mRNA表达.CCK8法、Annexin V/PI标记法和Transwell法观察CXCR7对THP-1细胞体外增殖、凋亡和侵袭的作用.结果:在初诊AML-M5患者PBMNC幼稚细胞表面CXCR7表达高于正常对照(P＜0.05),在THP-1细胞表面CXCR7也有高表达;THP-1细胞和AML-M5患者PBMNC中CXCR7蛋白和mRNA水平均明显高于正常对照(P ＜0.05);SDF-1α刺激可增高THP-1细胞增殖活性,但这种增殖活性可被CXCR7抗体抑制(P ＜0.01);CXCR7抗体不影响THP-1细胞凋亡(P＞0.05);CXCR7抗体可明显抑制SDF-1α诱导的THP-1细胞侵袭能力(P＜0.01).结论:CXCR7在急性单核细胞白血病患者及THP-1细胞中均有高表达,并参与细胞增殖和侵袭,阻断CXCR7表达有可能降低急性单核细胞白血病的浸润风险.
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抑制mll-af9融合基因表达对急性单核细胞白血病细胞THP-1增殖的影响
本研究探讨siRNA(small interfering RNA)对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1的mll-af9融合基因的影响.选择THP-1细胞特有的m11-af9融合基因为靶基因,设计并合成siRNA片段.以人急性单核细胞白血病细胞系THP-1为靶细胞,应用脂质体转染方法,将siRNA导入细胞,通过流式细胞仪检测siRNA转染效率,用RTPCR法比较转染前后mll-af9 mRNA表达水平的变化,以MTT法检测细胞增生抑制率,流式细胞术检测细胞周期的改变和细胞凋亡水平.结果表明:siRNA转染效率为(69.1±1.8)%,转染siRNA后THP-1细胞生长受到明显抑制,m11-af9融合基因表达量大幅度减少,细胞周期发生了明显的变化,主要表现为G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,并使细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡水平增高,而对照组siRNA转染后则无上述改变.结论:利用siRNA靶向干扰mll-af9融合基因的表达可以有效抑制人急性单核细胞白血病细胞THP-1的增殖.
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IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号通路调节研究
目的 研究IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号调节通路,探索DC -SIGN表达的信号调控网络.方法 以佛波脂(PMA)刺激THP-1细胞24h后加入IL-4作用48 h诱导DC-SIGN的表达,并设ERK阻断剂、NF-κB阻断剂、JAK-STAT阻断剂和MAPK阻断剂处理组.用RT-PCR检测DC-SIGN的mRNA表达,Western blot检测胞质内DC-SIGN蛋白的表达,流式细胞术检测细胞表面DC-SIGN的表达.另外,提取IL-4诱导0、10、20、30、60和120 min的THP-1细胞胞质和胞核蛋白,Western blot检测不同信号通路的信号蛋白及其磷酸化蛋白的变化.结果 IL-4可以大幅提高DC-SIGN在THP-1细胞上的表达,包括mRNA和胞膜蛋白水平.在mRNA、胞质和细胞表面蛋白表达3个水平上,ERK通路阻断剂阻断效果好,几乎完全阻断了IL-4的诱导效果,JAK-STAT和NF-κB通路阻断剂具有部分阻断效果,而p38通路阻断剂无阻断效果.信号蛋白检测结果显示,IL-4诱导0～120 min内,胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65、NF-κBp50、磷酸化IKB和磷酸化AKT随时间推移浓度逐渐升高,而p38MAPK及其磷酸化蛋白浓度无明显改变.胞核内胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65和NF-κBp50随时间推移浓度逐渐升高.结论 ERK、JAK-STAT和NF-κB通路参与了DC-SIGN启动子的活化,其中以ERK通路为主.
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microRNA 家族成员 let-7e 对人单核细胞系THP-1细胞活性的影响及机制研究
目的：研究let-7e对单核细胞系THP-1细胞凋亡和细胞因子分泌的影响及其机制。方法免疫荧光法检测cy3标记的mimic 对照转染THP-1细胞转染率，qRT-PCR法检测let-7e mimic及对照、let-7e inhibitor及对照转染THP1-细胞后let-7e的表达；MTT法检测转染后THP-1细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot法检测let-7e靶基因IFI6（interferon alpha-inducible protein 6）、EZH2（enhancer of zeste homolog 2）、caspase-3的表达；转染48h 后THP-1细胞用LPS 刺激2 h收集细胞培养上清，细胞因子芯片法检测上清中炎性因子的表达。结果 miRNA模拟物可以转染THP-1细胞，转染率约为75％，转染 let-7e mimic 12h 、24 h、48 h 后THP-1细胞的 let-7e 表达倍数分别为8．551±0．365、83．893±15．941、38．858±2．743，转染 let-7e inhibitor 12 h、24 h、48 h后THP-1细胞的let-7e表达倍数分别为0．594±0．174、2．427±1．229、3．053±0．207；let-7e mimic转染组THP-1细胞活性升高、凋亡率降低；miranda数据库分析证实let-7e与EZH2、IFI6、caspase-3结合的mirSVR score 分别为－0．1608、－0．5693、－09．423，证实IFI6、EZH2、caspase-3可能是let-7e的靶基因；let7-e mimic转染组IFI6、EZH2、caspase-3表达都有所下降；let-7e mimic 转染组 CD154、粒细胞集落刺激因子（ G-CSF）、CD54、IL-13、IL-1RA和IL-23表达有所下降。结论 let-7e有抗THP-1细胞凋亡的作用，可影响LPS诱导的细胞因子的表达。 let-7e可能通过调节其靶基因caspase-3、IFI6、EZH2对THP-1细胞的生物学功能产生影响。
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牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导THP-1细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6能力及其相关Toll样受体的差异性
目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)脂多糖(LPS)诱导人单核-巨噬样细胞THP-1分泌IL-1β、TNF-α、IL-6能力及相关Toll样受体(TLR)的差异. 方法 采用酚水法提取Pg ATCC33277株脂多糖(Pg-LPS),并用红外光谱法和鲎试验进行鉴定.采用ELISA试剂盒定量检测Pg-LPS作用的THP-1细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6水平.采用TLR2或TLR4单克隆抗体阻断试验联合ELISA检测,了解Pg-LPS结合靶细胞上Toll样受体的类型.实验中采用大肠杆菌0111:B4株脂多糖(E-LPS)作为对照. 结果 1μg/ml Pg-LPS作用THP-1细胞,分别于0.5、6和6 h检测分泌IL-1β、TNF-α和IL-6的水平明显升高(P
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不同阶段泡沫细胞模型的建立与鉴定
目的 建立不同阶段的泡沫细胞,并对其生物特性进行鉴定.方法 体外培养人THP-1来源的巨噬细胞(THP-M),由ox-LDL诱导其转化为不同阶段泡沫细胞,ELISA方法检测不同阶段泡沫细胞内总胆固醇和胆固醇酯含量;透射电镜和油红0染色光镜观察细胞内脂质,噻唑蓝染色法测定不同阶段泡沫细胞的活性变化规律.Western blot方法测定Ⅱ型微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)蛋白表达水平.结果 24h开始,THP-M细胞质内出现大量的红染颗粒或脂质空泡,总胆固醇和胆固醇酯均较对照组增加,细胞胆固醇酯含量大于总胆固醇的50％,泡沫细胞已经形成.噻唑蓝染色结果显示,自48h开始少量泡沫细胞出现死亡现象(存活率93.21±3.66％),60h和72h细胞存活率率分别为72.15±2.23％和63.06±1.83％.电镜扫描结果发现,24h细胞内脂滴聚集,24h内细胞浆自噬小体逐渐增多.36h、48h细胞内脂滴大小和形态各异,可见吞噬脂滴后尚未消化完全的自噬溶酶体,部分细胞膜破裂;60h和72h,细胞内自噬小体数量明显减少,细胞大量崩解.Western blot检测结果表明自噬标志性蛋白LC3Ⅱ表达水平变化规律与电镜观察自噬小体结果一致.结论 利用oxLDL诱导THP-M24h、36h-48h、60h-72h后,细胞形态和细胞内脂含量分别符合早期、中期和晚期泡沫细胞的生物特征,成功建立了早、中、晚期泡沫细胞模型,其中细胞活力变化可能与Ⅱ型凋亡(自噬性死亡)相关.为不同病程AS研究提供支持.
