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CPPs-BDI-1-载丝裂霉素白蛋白纳米微球的构建及其体外内化人膀胱癌细胞潜能的可行性研究
目的 分析CPPs-BDI-1-载丝裂霉素(MMC)白蛋白纳米微球三联体的构建及其体外对人膀胱癌细胞转染的潜在能力,为后续实验构建靶向膀胱癌的新型药物传送系统及治疗奠定基础.方法 于2011年2月至2013年10月,制备穿膜肽增强型绿色荧光蛋白TAT-EGFP、抗人膀胱癌单克隆抗体(BDI-1)、载丝裂霉素微球(MMC-NS),采用异型双功能连接剂SPDP耦联构建纳米微球三联体CPPs-BDI-1-MMC-NS.应用构建的纳米微球三联体体外转染人膀胱癌细胞,通过激光共聚焦、扫描电子显微镜及透射电子显微镜检测白蛋白纳米微球三联体对人膀胱癌细胞的内化潜能及其治疗效果.结果 应用异型双功能连接剂SPDP成功耦联穿膜肽、BDI-1、载MMC白蛋白纳米微球制成三联体CPPs-BDI-1-MMC-NS,纳米微球直径300 nm,可携带化疗药物.实验证实微球三联体具有很强的肿瘤细胞靶向性和穿膜活性,可以高效转染人膀胱癌细胞.结论 制备的白蛋白纳米微球三联体可以作为一种新型靶向膀胱癌的药物传送系统;发现肿瘤细胞膜表面微绒毛与载MMC白蛋白纳米微球三联体内化细胞内部相关,且微球内化入肿瘤细胞后微绒毛消失.
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人源性双亲性穿膜肽PKV14的合成及其对BHK-21细胞的影响
目的 合成人源性双亲性穿膜肽RRTLRRRRAAQRCG(PKV14),并研究其细胞穿膜效果和对细胞活性的影响.方法 采用固相合成法合成PKV14,采用高效液相色谱和质谱对PKV14进行验证,使用荧光显微镜和酶标仪观察PKV14在BHK-21细胞系中的穿膜效果,采用MTT实验法检测PKV14的细胞毒性.结果 合成了PKV14肽段,并且PKV14对于BHK-21细胞系的穿膜效率极高,细胞毒性实验表明PKV14对BHK-21细胞活性无影响.结论 PKV14是具有高穿膜活性,安全低毒的新型人源性细胞穿膜肽,有作为药物载体的潜力.
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Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性
目的：获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白（GFP）标记的 Tat-GFP 融合蛋白，探讨 Tat-GFP 在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法：应用 pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌 BL21感受态细胞，检测不同异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度（0.5和1.0 mmol·L-1）和不同温度（22℃和37℃）诱导融合蛋白的表达情况；利用 Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白，利用 GFP特异性抗体采用 Western blotting法分析洗脱液中的蛋白；激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。结果：0.5和1.0 mmol· L-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的 Tat-GFP蛋白量无明显差异；低温（22℃）诱导生产的 Tat-GFP蛋白量较37℃更高；Western blotting分析，GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白，条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联；细胞穿膜实验，绿色荧光分布于 MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。结论：低温诱导时大肠杆菌 BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高，所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。
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细胞穿膜肽-抗人膀胱癌单克隆抗体-载丝裂霉素白蛋白纳米微球三联体的靶向性和穿膜活性研究
目的:探讨细胞穿膜肽(TAT-EGFP)-抗人膀胱癌单克隆抗体(BDI-1)-载丝裂霉素白蛋白纳米微球(MMC-NS)三联体的靶向性和穿膜活性.方法:采用异型双功能连接剂SPDP,偶联TAT-EGFP、BDI-1、MMC-NS形成三联体偶联物,进行EJ人膀胱癌靶向结合及穿膜试验,通过激光共聚焦、扫描电子显微镜及透射电子显微镜检测其靶向结合特异性和穿膜活性.结果:成功地应用异型双功能连接剂SPDP偶联TAT-EGFP、BDI-1、载MMC白蛋白纳米微球制成三联体.TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS偶联物能够成功进入细胞发挥细胞毒作用.首次发现TAT-EGFP内化MMC-NS入EJ人膀胱癌细胞内部后微绒毛消失的现象.结论:TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS三联体有可能应用于膀胱肿瘤的靶向治疗.
