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胞外体--免疫治疗中的"特洛伊木马"
胞外体是源于多种真核细胞的多泡体,通过后者与质膜融合释放到细胞外的一种膜性小囊泡,在多种生理过程中发挥作用.近年研究发现,由抗原提呈细胞分泌的胞外体富集MHC I/ II类分子、协同刺激分子、热休克蛋白70和热休克蛋白90等多种生物活性分子于一身,像"特洛伊木马"一样,在体内外免疫调节中起关键作用.本文就胞外体的基本特征、生产纯化方法及其作为一种新型的亚细胞疫苗在抗肿瘤和抗病毒免疫中的应用前景予以综述.
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肿瘤细胞来源胞外体的形态学参数分析
目的 获得并分析肿瘤细胞来源胞外体的形态学参数.方法 收集喉表皮样癌细胞(Hep-2细胞)培养上清,蔗糖/重水密度梯度超速离心法分离纯化胞外体,透射电镜鉴定胞外体;应用计算机数字图像分析系统测量胞外体的长径、短径、周长、面积,计算其体积、等效直径及圆球度;应用SPSS数据处理软件(19.0版本)对采集到的数据进行统计学分析.结果 测量胞外体518个.胞外体长径均值为131.10 nm,75.68％的长径在100～150 nm之间,95％置信区间128.64～133.54 nm;短径均值为88.71 nm,65.83％的短径在75～105 nm之间,95％置信区间86.83～90.51 nm;周长均值为411.49 nm,76.25％的周长在320～490 nm之间,95％置信区间404.79～418.10 nm;面积均值为12237.87nm2,63.71％的面积在8 000～13 000 nm2之间,95％置信区间11820.41～12655.24 nm2;等效直径均值为61.41 nm,94.98％的等效直径在43～80 nm之间,95％置信区间60.40～62.32 nm;圆球度均值为1.34,63.89％的圆球度在1.12～1.52之间,95％置信区间1.28～1.31.结论 利用计算机数字图像分析系统可获得胞外体长径、短径、周长、面积、等效直径、圆球度形态学参数.形态学参数的建立为量化胞外体的大小及胞外体鉴定提供了数字化资料.
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肿瘤细胞来源的胞外体对CIK细胞活性的影响
目的 探讨恶性肿瘤对于细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer,CIK)细胞的增殖抑制以及诱导凋亡等方面的作用,并探讨肿瘤细胞影响CIK的作用机制.方法 在CIK细胞培养体系中分别加入胃癌细胞系BGC-823、结肠癌细胞系HCT-8细胞的培养上清,观察对于CIK细胞的增殖倍数、主要效应细胞(CD3+CD56+细胞)的含量以及杀伤活性的影响.为探讨肿瘤细胞来源的胞外体在影响CIK细胞活性中的作用,采用超速离心技术分离肿瘤细胞培养上清中的胞外体结构,观察其对于CIK细胞的抑制作用.结果 培养体系中肿瘤培养上清的加入降低了CIK细胞的增殖倍数和CD3+CD56+细胞的比例,并且肿瘤培养上清的加入抑制了CIK细胞对于同类肿瘤细胞的细胞毒活性.肿瘤细胞和CIK细胞的共同培养增加了CIK细胞中凋亡细胞的比例,同时降低了增殖细胞比例.通过超速离心方法从BGC-823胃癌细胞培养上清液中分离出胞外体结构,电镜显示为直径介于40～100 nm之间的膜性微小囊泡,并且BGC-823细胞培养上清中胞外体结构的去除可以减轻其对于CIK细胞的增殖抑制.结论 肿瘤细胞对于CIK细胞的增殖和生物学活性具有抑制作用,免疫抑制性细胞因子和胞外体都是可能的作用机制.
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胞外体认识之新进展
胞外体是由多种细胞分泌的一种膜性小囊泡,参与多种生理及病理生理过程.近年研究发现,由抗原提呈细胞分泌的胞外体富集MHC Ⅰ/Ⅱ类分子、协同刺激分子、热休克蛋白70～90等多种生物活性分子于一身,在体内外免疫调节中起关键作用.就胞外体的基本特征及其作为一种新型的亚细胞疫苗在抗肿瘤和抗病毒免疫中的应用前景予以综述.
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肿瘤细胞来源的胞外体诱导机体免疫耐受及其临床应用
胞外体(Exosomes,EXO)是真核细胞释放的纳米级膜性小囊泡,是由细胞的多泡体(Multivesicular bodies,MVBs)出胞时与细胞膜融合后,向细胞外释放的囊性结构.多种类型真核细胞可以释放EXO.EXO生物学功能与其所来源的细胞直接相关[1],其诱导的免疫激活作用早已备受关注,并应用至肿瘤免疫的实验研究.然而,越来越多的研究表明,EXO在特定环境中亦同样可诱导免疫耐受,这无疑给肿瘤的免疫治疗带来了新的挑战.EXO诱导的免疫耐受可通过下调机体免疫监视,促进肿瘤生长及转移.这一新发现逐渐平息了研究者对EXO作为抗肿瘤新方法的狂热,但却为治疗自身免疫性疾病、同种异体移植等疾病带来了新希望.EXO诱导的免疫耐受应用于相关疾病的治疗将成为研究热点.
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鸭坦布苏病毒感染对BHK-21细胞分泌胞外体的影响
目的:探讨鸭坦布苏病毒感染BHK-21细胞对胞外体的影响,进一步研究鸭坦布苏病毒的致病机制.方法:利用鸭坦布苏病毒AH-F10株感染BHK-21细胞,并设置未感染病毒的对照组.用PEG法提取感染病毒的BHK-21细胞和对照组细胞上清中的胞外体,通过电镜观察、Western blot检测对胞外体进行鉴定,并对提取的两组胞外体进行质谱鉴定分析.结果:电镜观察到纯度高的内部色浅、边缘浓染的杯状囊泡,直径30~160 nm.感染组胞外体的平均粒径大小大于对照组胞外体的平均粒径大小.Western blot试验中,均检测出CD9、CD63分子.应用液相质谱法从胞外体中鉴定出106种蛋白,其中感染坦布苏病毒组共检测出84种蛋白,对照组49种蛋白,有27种共同蛋白分子.结论:鸭坦布苏病毒感染BHK-21细胞会影响细胞胞外体的分泌,影响胞外体粒径大小及其蛋白组成成分.本试验为进一步研究坦布苏病毒的感染和致病机制奠定了基础.
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肿瘤来源的胞外体对肿瘤进展的影响
胞外体是真核细胞在正常生理过程中分泌的一种具有多种细胞膜结构的小囊泡,作为一类重要的细胞间信号分子,胞外体具有多种生物活性成分,其异常分泌是恶性肿瘤的标志.胞外体与肿瘤细胞生长、肿瘤血管生成、免疫抑制及化疗耐药关系密切.因此,探究胞外体的形成过程、主要组成成分及肿瘤相关的胞外体在肿瘤进展、免疫调节中的作用有助于进一步了解肿瘤进展过程,具有重要意义.
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淋巴瘤细胞释放的EXO的蛋白质组分分析
目的:分析淋巴瘤细胞释放的胞外体(lymphoma cell-derived exosomes,LCEX)的蛋白质组分.方法:利用Shotgun技术,分析淋巴瘤Raji细胞系和Raji细胞分泌的EXO中所含蛋白种类并进一步进行鉴定.利用网络数据库进行蛋白组分功能分析.结果:Raji细胞共鉴定出了蛋白322种,Raji细胞系分泌的EXO共鉴定出了蛋白197种,其中139种蛋白为二者共有,其余58种为EXO所特有.采用了GO(gene ontology数据库对Raji细胞释放的EXO蛋白功能进行了分析.①LCEX可能主要参与了对细胞内外刺激的应答及对应答的定位(包括与相关细胞之间的粘附、结合等),并参与免疫调节.②利用KEGG数据库分析发现,Raji细胞释放的EXO所负载的蛋白中涉及细胞粘附分子的有8种蛋白分子,主要为ICAM分子及MHC分子；③涉及抗原加工和提呈的有12种蛋白分子,主要是HSP70和HSP90家族的.结论:EXO负载了大部分其来源细胞的蛋白,所负载的蛋白中涉及多种参与免疫调节作用的分子,可能是淋巴瘤细胞参与肿瘤免疫的调节重要机制.
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Exosome介导的细胞通讯在中枢神经系统疾病中的研究进展
Exosome(胞外体)是一种可由多种细胞分泌的纳米级膜性小泡,直径为40～100 nm,其中含有细胞特异性的信号分子、蛋白质、mRNA和miRNA.这些成分因为有脂质膜的保护而具有充分的生物学活性,可以在细胞与细胞之间进行信息传递,从而有效发挥对受体细胞的调节作用.本文综述了近几年关于exosomes的研究成果,从exosome的基本特征、生物学功能、exosomos介导的细胞通讯在中枢神经系统疾病发病机制及治疗潜能四个方面,对exosomes的研究现状作一介绍,旨在探讨exosomes在细胞通讯研究中所面临的问题,为以exosomes作为调节靶点治疗中枢神经系统疾病提供理论参考.
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胞外体的表征及其功能
胞外体(exosome)是由细胞多泡体(multivesicular body,MVB)与质膜融合并把其内含小泡排泌到细胞外而形成的一群膜性小囊泡,为一形态学定义.现已发现多种细胞可以分泌胞外体,它们在形成过程、形态、密度等方面有诸多的相似性.但由于其来源细胞各异,导致不同来源的胞外体在组成成分、作用方式以及生物学功能方面存在巨大的差异.已有的研究结果表明,胞外体具有提呈抗原,抑制或促进肿瘤发生,介导免疫耐受以及传递生物学信息等多种生理病理作用.对胞外体的深入研究,可能为疾病诊断和药物开发提供新的思路,因此引起了学者的广泛关注.现就胞外体的形成、生化特征、提取方法及其生物学功能作一综述.
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白血病细胞来源胞外体的生物学特性及其致敏DC的抗白血病效应
目的:探索白血病细胞来源的胞外体(leukemia cell-derived exosome,LEX)的生物学特性及其致敏DC的抗白血病免疫效应.方法:超速离心分离纯化BCR-ABL阳性的白血病K562细胞来源的胞外体(LEXK562),采用免疫电镜及Western blotting检测LEXK562中热激蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)及BCR-ABL的表达,采用激光扫描共聚焦显微镜及流式细胞术检测LEXK562靶向结合DC的动力学,采用LDH释放法以及小鼠模型体内实验检测LEX及其致敏DC的抗白血病免疫效应.结果:与其他细胞来源的胞外体相似,K562细胞来源的胞外体LEXK562为直径50 ～ 100 nm的囊状结构,且表达K562细胞特异性的BCR-ABL和HSP70分子.LEXK562在体外可靶向结合DC,3～4h到达高峰,并能在DC中稳定存在72 h以上.LEXK562致敏DC(DC/LEXK562)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)可有效杀伤K562靶细胞,效靶比为50:1时,其杀伤活性显著高于LEXK562诱导的CTL[(68.6±5.7)％vs(22.5±2.9)％,P＜0.01]；体内实验进一步证实,白血病L1210细胞来源的胞外体(LEXL1210)免疫后小鼠接种L1210细胞的成瘤率明显高于LEXL1210致敏DC(DC/LEXL1210)免疫小鼠的成瘤率[(54.17±8.33)％vs(16.67±4.18)％,P＜0.05].结论:LEX表达白血病细胞相关抗原,LEX体外可靶向结合DC,其致敏的DC能诱导更强的抗白血病免疫效应.
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Exosomes与肾脏生理及疾病
胞外体(exosomes)是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质中直径30 ～ 100 nm的膜性小囊泡,内含来源细胞的mRNA、miRNA和蛋白质等成分,能反映来源细胞的生物学信息,可能成为潜在的生物学标志物.Exosomes在信号转导、诱导机体抗肿瘤和免疫耐受等方面的作用是近年来研究的热点,并已成为一种新型治疗手段.尿液exosomes与肾脏生理功能及疾病之间有着密切的关系,但其研究尚处于初期阶段.文章就exosomes的生物学特性、生理功能、分离纯化及其在肾脏疾病方面的标志物作用和治疗价值的研究进展作一综述.
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肺癌细胞裂解物负载对树突状细胞分泌的exosome诱导抗肿瘤作用的影响
目的 为制备高效的胞外体(exosome)肿瘤疫苗提供理论依据.方法 用细胞因子诱导培养树突状细胞(DC),将肺癌细胞裂解物负载DC,提取exosome;用exosome活化T细胞(负载组),以未负载DC的exosome(未负载组)及肺癌细胞裂解物负载DC(DC组)活化的T细胞为对照,MTT法检测三组肺癌细胞的杀伤率.结果 exosome中有HSP70、HLA及CEA表达.活化T细胞/肺癌细胞为25∶1、10∶1 、5∶1时负载组杀伤率均明显高于未负载组及DC组(P均＜0.05).结论 肺癌细胞裂解物负载能增强DC分泌的exosome诱导的抗肿瘤作用；本研究为制备高效的exosome肿瘤疫苗提供了理论依据.
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胞外体与婴儿巨细胞病毒感染的相关性
目的 研究婴儿感染巨细胞病毒(CMV)后体内胞外体(EXO)水平的变化,以及细胞因子IL-4、γ干扰素(IFN-γ)水平在CMV感染婴儿血清和(或)EXO中的变化,探讨CMV感染对婴儿免疫功能的影响以及EXO在CMV感染发生发展过程中的作用.方法 选择山东大学齐鲁医院儿科收治的53例CMV感染婴儿(CMV感染组),排除其他病毒感染及遗传代谢性疾病;42例非CMV感染同龄儿童为对照组.分别采用ELISA法检测其血清EXO水平及血清EXO中IL-4水平,以及血清中IFN-γ水平.结果 CMV感染组患儿血清EXO、IFN-γ水平均较对照组显著降低(Pa＜0.05),血清IL-4水平较对照组升高,但差异无统计学意义(P>0 05),EXO中IL-4水平较对照组显著升高(P<0.05);二组血清IL-4与EXO IL-4呈正相关(r=0.794,P=0.000),感染组血清IL-4与EXO IL-4呈显著正相关(r=0.902,P=0.000).结论 1.CMV可破坏人体正常的Th1/Th2平衡,Th2免疫应答占优势,Th1免疫应答受抑制.2.CMV感染后,与Th1细胞相关的细胞因子IFN-γ减少,而与Th2细胞相关的细胞因子IL-4增多.3.EXO可作为细胞因子IL-4分泌的方式,介导机体细胞免疫功能的降低和Th1/Th2失衡,导致免疫耐受和免疫抑制,从而使病毒难以清除,感染持续并慢性化.
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口腔鳞癌细胞分泌的胞外体对其生物学行为的影响
目的:研究口腔鳞状细胞癌细胞细胞株(OSC-4)分泌的胞外体对细胞生物学行为的影响.方法:培养OSC-4,从其上清培养液中分离提纯胞外体(exosome,EXO),CD9标记,将提取的胞外体作用于OSC-4,MTT检测胞外体对OSC-4增殖能力的影响,细胞划痕实验检测胞外体对OSC-4迁移能力的影响,transwill小室侵袭实验检测胞外体对OSC-4侵袭能力的影响.结果:细胞上清液提取物免疫金标结果可见金标记的CD9,即分离提纯物为胞外体;MTT检测结果显示胞外体作用后的OSC-4的增殖能力增强(P＜0.05),细胞划痕实验结果显示其迁移能力增强和transwill小室侵袭实验结果显示其侵袭能力也增强(P＜0.05).结论:OSC-4分泌的胞外体可以促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、浸润能力.
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骨关节炎患者成骨细胞胞外体miRNAs表达谱的差异
目的:通过分析骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者软骨下骨组织中成骨细胞胞外体miRNAs的表达差异,探究OA发生发展过程中可能涉及的关键胞外体miRNAs.方法:共纳入6名膝OA患者,收集其膝关节软骨下骨组织,选取磨损严重侧为OA组,取磨损较少侧为正常对照组.细胞培养后提取成骨细胞胞外体,进行特征鉴定.提取胞外体miRNAs,用高通量测序并筛选两组间表达差异显著者(log2Ratio≥2)进行靶基因预测分析,并进一步行定量反转录PCR分析.结果:提取物经鉴定为胞外体,在扫描电镜下呈囊泡状双层膜结构,直径30～200 nm,体积峰度50～150 nm.高通量测序共筛出5个OA组表达显著上调的miRNAs,差异倍数大者为hsa-miR-4717-5p,预测靶基因为RGS2;定量反转录PCR亦显示OA组hsa-miR-4717-5p相对表达量较对照组显著增高(2.243 vs 0.480,P＜0.01).结论:OA患者成骨细胞胞外体miRNAs表达谱较正常者有显著差异.部分表达显著上调的miRNAs可能通过代谢相关通路介导OA的发生和发展.
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淋巴瘤细胞胞外体生物学特性及其抗淋巴瘤效应的研究
目的:研究淋巴瘤细胞胞外体(lymphoma cell-derived exosomes,LCEX)的生物学特性及其在抗肿瘤免疫中的作用,探讨以胞外体为基础的肿瘤免疫治疗的可行性.方法:本研究以Raji细胞株为淋巴瘤细胞模型,应用免疫电镜,Western blot,共聚焦显微镜以及细胞毒杀伤实验等技术对其释放的LCEX的生物特性进行初步研究.结果:淋巴瘤细胞同样也能释放胞外体,与其他肿瘤细胞相似,LCEX同样负载重要的免疫分子HSP70及ICAM-1分子.同时,LCEX能够在体外靶向结合树突状细胞(dendritic cell,DC),并能诱导抗原特异性的抗淋巴瘤效应.结论:淋巴瘤细胞同样能够释放胞外体,LCEX负载有淋巴瘤细胞的相关蛋白分子,有望成为淋巴瘤细胞抗原的重要来源之一,体外致敏DC能够诱导抗淋巴瘤免疫,在淋巴瘤免疫治疗方面具有广阔的应用前景.
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胞外体在微RNA转运过程中的作用
胞外体来源于多种真核细胞的多泡体（MVBs）内部的小囊泡，在电镜下呈典型的杯状，由脂质双层膜包绕的扁平半球体，直径约40～100 nm。MVBs 可能通过内出芽的方式形成小囊泡，而一些蛋白、脂质和核酸就分选进入这些小囊泡中，被释放到细胞间隙成为胞外体［1］。胞外体的实质是细胞内产生的小囊泡，在形成过程中“不可避免”携带参与细胞生命过程的各种蛋白、脂质以及核酸。微 RNA（MicroRNA）是由21～25个核苷酸构成的非编码小分子 RNA，曾经被视为无功能的分子［2］。近年来已经成为分子生物学领域的研究热点，参与了细胞内多种基因的表达调控［3］。已经证实 microRNA 存在于胞外体中，胞外体如同“特洛伊木马”参与 microRNA 在细胞间的转运而影响靶细胞功能。
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母乳来源Exosome:母婴信息传递新途径
母乳不仅提供母乳喂养婴儿适量的营养,还在预防婴儿体内感染和促进组织器官发育中发挥着重要的生理功能.胞外体是一类直径大小在40～100 nm的膜囊体,是由多囊胞内体与细胞膜融合而成.胞外体不仅在细胞间传递膜组成成分还传递核酸分子,提示它们在细胞间信息传递的重要作用.近期研究发现母乳胞外体在新生儿免疫系统建立中发挥着重要的作用.因此,来自母乳的胞外体RNA通过微泡的转运方式进入新生儿体内,在疾病预防中发挥重要作用.
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树突状细胞胞外体(Exosome)的超滤离心法提取及形态观察
目的:利用树突状细胞(DC)胞外体(Ex)的物理特性,探讨基于DC-Ex的大小和密度,用超滤离心法制备DC-Ex的实验方法,以改进传统方法、提高收获效率.方法:选用小鼠树突状细胞株DC2.4为研究对象,收集细胞培养上清,中空纤维器去除细胞及细胞碎片,Amicon Ultra超滤离心管压缩体积,密度梯度超离心纯化获得DC-Ex提取物.对照组则采用传统的分级分离方法.应用透射电镜进行形态学鉴定,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行检测.结果:DC-Ex提取物超微结构形态及SDS-PAGE带型和文献报道类似,包含有主要的特征性标志物分子MHC-Ⅰ,MHC-Ⅱ,CD80和CD86;与分级分离法相比,超滤离心法耗时少,产量和纯度较高.结论:超滤离心法是一种简便高效的提取Ex的方法.
