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抗病毒多肽疫苗临床研究现状
自20世纪80年代Strohmaier等[1]人发现口蹄疫病毒(FMDV)的146～154及200～213氨基酸肽段含免疫学位点,从而找到了一种新型疫苗,即肽疫苗.
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口蹄疫病原免疫学的分子基础
FMDV属于微RNA病毒科,口蹄疫病毒属成员,是一种单股正链RNA病毒.基因组长度约为8 500 nt, 5'端共价连接一种特殊的小蛋白VPg(3B),其后为一个约1 300 nt的5'非编码区,与宿主RNA相比,FMDV的5'非编码区没有帽子结构,而是靠一个内部核糖体进入位点(IRES)启动基因组的复制;3'端含有poly(A)的尾巴,尾巴上游为100 nt的非编码区.5'非编码区和3'编码区之间为一个大约7 500 nt 的开放阅读框(ORF),编码一个2 300 aa多聚蛋白,这个多聚蛋白在感染细胞中或体外翻译体系从未发现,因为其被病毒编码的蛋白酶迅速裂解,这个蛋白酶也存在于多聚蛋白中.
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抗O型口蹄疫病毒DNA疫苗的建立
目的:研制抗"O"型FMDV的DNA疫苗.方法:以"O"型口蹄疫病毒(FMDV)Vp1免疫活性肽基因串联片段取代猪IgG H链可变区的CDR3区,并与真核表达载体pCDM8相连构建表达载体pCDM-FH.用表达载体pCDM-FH DNA对豚鼠及猪进行肌肉注射,检测该疫苗的免疫效果 .结果:该DNA疫苗可诱导出抗FMDV专一性的中和抗体及效应性T细胞.攻毒试验表明,DNA 疫苗pCDM-FH可使被免疫豚鼠及猪发病推迟,症状减轻.结论: 该DNA疫苗可激发明显的免疫应答及保护效果.为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示.
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整联蛋白与口蹄疫病毒感染
整联蛋白是一类重要的细胞表面分子,除介导细胞与胞外基质及细胞间的粘附外,还对细胞的识别、生长和分化具有重要作用.FMDV对细胞的侵染依赖于宿主细胞受体,整联蛋白作为口蹄疫病毒侵入细胞的关键决定簇,在致病机制、组织和器官嗜性中具有重要作用.本文就整联蛋白的结构、功能及在FMDV感染中的作用等方面进行了综述,以期阐明FMDV侵染细胞的机制.
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重组牛O型口蹄疫病毒VP1表位疫苗的构建、表达、纯化及免疫活性研究
为构建重组牛O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1表位疫苗,并对其免疫学活性进行研究.利用计算机模拟构象的方法筛选出牛O型FMDV VP1表位六聚体重组蛋白的佳表位组合形式,通过PCR及基因克隆等方法构建含编码该重组蛋白基因的质粒,大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,镍亲和层析法纯化.通过间接ELISA方法初步检测该蛋白免疫豚鼠血清中的抗FMDV抗体水平;再用活病毒FMDV进行细胞中和实验和乳鼠保护实验以检测豚鼠血清中具有保护性的抗FMDV中和性抗体的滴度.结果:构建了一种编码牛O型口蹄疫病毒VPl表位六聚体重组蛋白的质粒,经诱导表达并纯化后得到重组蛋白,命名为"MIP10".ELISA检测结果显示,MIP10蛋白免疫的豚鼠血清中含有高水平的抗牛O型FMDV抗体.细胞中和实验和乳鼠保护实验结果显示,MIP10蛋白免疫的豚鼠血清中含有针对牛O型FMDV的保护性抗体.重组牛O型VI蹄疫病毒VP1表位疫苗MIP10能够在动物体内诱导产生具有保护性的抗牛O型FMDV中和性抗体,有望开发成预防牛O型FMDV感染的新型疫苗.
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用原位RT-PCR对BHK-21细胞中的FMDV检测和定位
目的为了明确FMDV在BHK-21细胞中的复制和增殖部位,建立原位检测FMDV的方法.方法以地高辛标记的寡核苷酸作为探针,用间接原位RT-PCR技术对实验接种FMDV的BHK-21细胞中的FMDV RNA进行检测和定位.结果在接毒细胞的细胞质中有大量强阳性蓝染颗粒,阴性对照细胞中没有蓝染颗粒出现,也没有明显的背景染色.结论结果表明FMDV RNA在细胞的细胞质中进行复制和增殖,同时也表明原位RT-PCR是检测细胞内病毒的一种敏感、特异的方法.
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口蹄疫病毒O/China/99株多基因植物组成型表达载体的构建及序列分析
目的构建包含FMDV结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C以及部分2B的基因片段P12X3C的植物组成型表达载体,为FMDV可饲疫苗的研制奠定基础.方法通过PCR扩增法,从pGEM/P12A质粒和pGEM/3C质粒中扩增P12A及部分2B基因(P12X)、 3C基因,将获得的P12X与3C片段经BamHI/SpeI和SpeI/SalI双酶切后,与经BamHI/SalI双酶切后的pUC18质粒大片段连接,得到重组质粒pUC18/P12X3C,pUC18/P12X3C质粒经BamHI/SalI双酶切后的大片段与经同样双酶切的植物表达载体pBin438连接,转化子经酶切、PCR及测序鉴定后,获得包含FMDV O/China/99株P12X3C片段的植物组成型表达载体pBin438/P12X3C,后通过三亲交配法,将表达载体pBin438/P12X3C导入农杆菌.结论成功构建FMDV多基因的植物组成型表达载体.
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抗口蹄疫蛋白疫苗与DNA疫苗混合物的免疫原性研究
目的研究抗口蹄疫蛋白及DNA疫苗混合物免疫原性. 方法以O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1免疫活性肽基因串连片段取代猪IgG H链基因可变区的CDR3区构成融合基因.然后分别与原核表达载体pET28b及真核表达载体pCDM-8 构建抗口蹄疫蛋白疫苗pET28b-FH及DNA疫苗PCDM-FH.用蛋白疫苗pET28b-FH和DNA疫苗pCDM- FH及其混合物免疫猪后,用攻毒实验检测其效果.结果攻毒后,抗口蹄疫蛋白疫苗pET28b-FH及DNA疫苗pCDM-FH单独免疫能分别使猪发病推迟10天和1天,症状减轻;而混合疫苗免疫效果比阴性对照好而不及这两个疫苗单独免疫效果.结论抗口蹄疫蛋白疫苗pET28b-FH及DNA疫苗pCDM-FH单独免疫能使猪发病推迟,症状减轻;而混合疫苗免疫效果较差,免疫方法仍需改进.
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口蹄疫病毒基因组结构及功能新研究进展
口蹄疫是由口蹄疫病毒( Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性人兽共患传染病.口蹄疫的暴发和流行带来严重的经济损失和不良的政治影响,同时对人们身体健康带来严重威胁,被世界动物卫生组织列为必须上报的动物传染病之首.FMDV基因组RNA全长约为8.5kb,由5’非翻译区(5'UTR),开放阅读框架(ORF)和3’非翻译区(3' UTR)组成,尾部带有PolyA(图1).5'UTR全长约1 300bp,前端是VPg,紧接着是S片段、Poly(C)区段,功能未知区和内部核糖体结合位点[1].
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口蹄疫病毒非结构蛋白3Dpol的研究进展
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病.FMD是OIE规定的A类动物疫病之一,严重影响畜牧业的发展,对世界公共卫生存在着巨大影响,造成巨大的经济损失,素有"政治经济病"之称.FMD的致病原是小RNA病毒科,口蹄疫病毒属成员,于1897年首次确定.FMDV是正链RNA分子,长约8 500 bp,包裹于由60个拷贝的4种病毒结构蛋白VP1-4构成的二十面体的衣壳中.
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口蹄疫病毒L~(pro)蛋白的致病机理
口蹄疫( foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒( FMDV)引起的一种急性、热性、高度传染性和可快速远距离传播的动物疫病, 此病流行广泛, 发病率高, 被国际兽医局(OIE)列为A 类传染病的首位.
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免疫细胞和细胞因子在口蹄疫免疫应答中的作用
口蹄疫是由小RNA病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒(FMDV)引起的急性、热性、高度接触性的传染病.已有一百多年的历史,至今尚未在全球范围得到消灭.
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FMDV OH99株基因组全序列的测定及其基因特征研究
采用RT-PCR方法对FMDV OH99株基因组全序列进行了分子克隆与测序.结果表明OH99株基因组全基因组序列长8040nt,其中5'NCR长1026nt,前导蛋白(L)编码区长603nt.该毒株结构蛋白与非结构蛋白编码区的核苷酸序列为6318nt,3'NCR长93nt,其后是poly(A)尾巴,测序结果表明该结构至少含有56个A.应用分子生物学软件,将OH99株与其它参考毒株进行了序列比较,并对其基因特征、推导的氨基酸序列进行了研究分析.结果显示,在分类地位上OH99株归属于O型FMDV,与OTY TW/97具有较高的同源性,而与其他参考毒株的差异性比较大,而且在基因组功能未知区域和3A编码区域具有两处明显的基因片段缺失现象,其中3A编码区缺失30nt,与OTY TW/97株相同,但功能未知区域的缺失状况与OTY TW/97稍有差异.根据VP1基因序列,对OH99株与参考毒株进行了系统发生树分析,分析结果表明OH99株与OTY TW/97株在同一基因型内,其遗传关系近,而与其毒株遗传关系较远.
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O型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白疫苗的构建、表达和纯化
目的为了克服灭活口蹄疫病毒疫苗可能存在的传播病毒的潜在危险,构建一种能预防O型口蹄疫病毒感染的VP1表位重组蛋白疫苗.方法采用O型口蹄疫病毒(FMDV)表面VP1蛋白上的B细胞表位肽和T细胞表位肽,以PCR扩增和克隆连接等方法构建VP1表位六聚体重组蛋白(VP1epi)基因,并在大肠杆菌中进行诱导表达,镍亲和层析纯化.用ELISA法检测VP1epi免疫豚鼠血清中抗FMDV抗体的水平.结果构建了一种由FMDV表面VP1中B细胞表位肽重复六次的蛋白质多肽,采用pET28原核表达系统,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达产量约占菌体蛋白的30%左右,经镍亲和层析后获得纯度高于90%的VP1表位重组蛋白.VP1epi免疫的豚鼠血清中含有一定量的抗FMDV抗体.结论VP1epi重组蛋白能诱导机体产生抗O型FMDV的抗体,说明这种重组蛋白可能成为预防O型FMDV感染的基因工程蛋白质疫苗.
