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柠檬酸铁铵通过活性氧途径影响人丙型肝炎病毒的蛋白翻译
目的：研究铁对HCV IRES依赖的病毒蛋白翻译的影响，以及其与细胞ROS活性变化的关系。方法以脂质体细胞转染法，将双荧光素酶报告基因表达载体pCI-Rluc-HCV IRES-Fluc转染人肝癌细胞系Huh-7细胞。在0、50和300μmol／L浓度的柠檬酸铁铵（ FAC）作用24 h后，双荧光素酶报告基因检测系统检测HCV IRES依赖的病毒蛋白翻译的变化。 ROS荧光染色方法检测细胞ROS活性变化，Western blot 法检测细胞中Nrf2蛋白表达的变化。加入100μmol／L的DPI后，检测300μmol／L FAC实验组中HCV蛋白翻译的变化和细胞ROS的变化。结果与对照组相比，FAC增加了Huh-7细胞HCV IRES依赖的病毒蛋白翻译、增加了ROS活性，并且可以引起核转录因子Nrf2表达增加（ P＜0.05）。加入ROS抑制剂DPI后，可以显著抑制FAC诱导的HCV IRES依赖的病毒蛋白翻译及Nrf2蛋白的表达（ P＜0.05）。结论 FAC可以诱导细胞HCV IRES依赖的病毒蛋白翻译增加，可能与FAC促进Huh-7细胞产生过多的ROS有关。
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内部核糖体进入位点控制hytk基因和绿色荧光蛋白的表达
构建一种带有绿色荧光蛋白基因(gfp)和hytk cDNA(潮霉素磷酸转移酶和HSV-tk的融合基因)的新型真核表达载体,用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤中的转染效率.利用脑炎心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),将gfp的cDNA与hytk真核表达载体重组,构建获得含gfp和hytk基因的重组质粒;Lipofectin介导下分别转染COS-7细胞及人膀胱癌细胞株EJ,并检测其表达情况.结果示该载体在瞬时表达及稳定表达时均可获得hytk及gfp的良好表达.说明含gfp和hytk基因双顺反子真核表达载体的构建成功,为临床应用自杀基因治疗膀胱恶性肿瘤提供了新的治疗工具及随访检测手段.
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双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES的构建与鉴定
目的:为适应恶性肿瘤免疫治疗中多基因联合应用的需要,在真核表达载体pVAX1的基础上,利用内部核糖体进入位点IRES序列,构建双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES,以增强DNA疫苗的免疫疗效.方法:通过PCR扩增获得目的基因IRES并定向克隆到pVAX1载体中,然后在IRES序列的上下游分别插入红色荧光蛋白基因DsRed1和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP,瞬时转染人胚胎肾细胞293T,通过流式细胞术和免疫荧光验证基因表达.结果:pVAX1-IRES经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致,DsRed1基因和EGFP基因在pVAX1-IRES载体中,不仅可以分别表达,而且可以同时表达,显示该双顺反子真核表达载体构建成功.结论:pVAX1-IRES双顺反子表达载体的构建,为基因联合表达和恶性肿瘤的免疫治疗作了必要准备.
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用IRES及dhfr构建哺乳动物细胞双表达载体
目的:构建同时表达抗体的重链和轻链的哺乳动物细胞双表达载体.方法:将微小RNA病毒内部核糖体进入位点(IRES),亚克隆到质粒载体pCdhfr1多克隆位点,构建了哺乳动物细胞双表达载体pCdhfr5.结果:pCdhfr5具有两处多克隆位点, 由IRES相连.能同时表达两个外源基因.把绿色荧光蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因分别亚克隆到pCdhfr5的上下游多克隆位点MCS1和MCS2构建了表达质粒pFN, 经脂质体法转染CHO细胞,筛选到同时表达新霉素磷酸转移酶和绿色荧光蛋白的表达株.结论:双表达载体的构建成功为进一步研究表达抗体全分子的CHO细胞株奠定了基础.
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死亡相关蛋白5研究进展
蛋白质生物合成是遗传信息的翻译过程,包括起始、延伸和终止3个阶段,其中起始阶段是调控的关键.死亡相关蛋白5是新近发现的翻译调控因子,能够调控真核生物mRNA依赖5'帽状结构翻译及经内部核糖体进入位点途径翻译的起始.随着研究的深入,发现死亡相关蛋白5在细胞分化及凋亡等病理生理过程中具有重要作用.本文就近年来死亡相关蛋白5研究进展作一综述.
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VEGF165和SDF-1双基因共表达腺病毒载体的构建及其在大鼠缺血脑组织中的表达
目的 构建血管内皮生长因子(VEGF)165与基质细胞衍生因子 (SDF)-1双基因共表达腺病毒载体Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1,并观察其在缺血大鼠脑组织中的共表达情况.方法 将VEGF165和SDF-1基因通过内部核糖体进入位点(IRES)进行定向连接,以同源重组的形式构建双基因共表达重组穿梭质粒pDC316-VEGF165-IRES-SDF-1,将其与骨架质粒pBHGlox_E1以脂质体转染HEK293细胞,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒,经多轮扩增后获得纯化的腺病毒载体Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1;以线栓法构建大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,并以立体定向微量注射的方法将构建的病毒载体注入大鼠侧脑室,以RT-PCR和免疫印迹法观察其介导VEGF165和SDF-1基因在缺血脑组织中的共表达情况.结果 PCR、双酶切和基因测序等结果显示,重组质粒和腺病毒载体构建正确,并能够介导VEGF165和SDF-1两种基因在缺血的大鼠脑组织内共表达.结论 成功构建了携带VEGF165和SDF-1双基因的腺病毒载体Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1,Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1可以介导VEGF165和SDF-1双基因在缺血大鼠脑组织内共表达.
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人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定
背景：人胶质细胞源性神经营养因子(glial ；cel line - derived neurotrophic factor， GDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165， VEGF 165)在细胞分化过程中有重要作用。
目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-GDNF-VEGF 165并对其进行鉴定。
方法：采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因，然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES 2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES 2-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES 2-VEGF 165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换 EGFP 的方式插入pIRES 2-BDNF-EGFP中，后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES 2-GDNF-VEGF 165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用 RT-PCR 与Western-blot 方法检测双基因的表达。
结果与结论：DNA测序显示，提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES 2-GDNF-VEGF 165双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带，经 Bam HI/Not I 双酶切后切出IRES-VEGF 165片段，经Bgl II/Not I双酶切后切出 GDNF-IRES-VEGF 165片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。 -
pIRES 2-BDNF-VEGF 165真核表达载体的构建与鉴定
背景：人脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor ， BDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGF 165)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患，利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。
目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-BDNF-VEGF 165并对其进行鉴定。
方法：采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人脑源性神经营养因子基因，然后将人脑源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES 2-EGFP多克隆位点构建为pIRES 2-BDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES 2-VEGF 165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换 EGFP 的方式插入pIRES 2-BDNF-EGFP中，后构建成为含有即内部核糖体进入位点的pIRES 2-BDNF-VEGF 165双基因共表达载体。通过双酶切和 DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用 RT-PCR 与Western-blot 方法检测双基因的表达。
结果与结论：DNA测序显示，提取的人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，片段长度分别为744 bp和576 bp。构建的pIRES 2-BDNF-VEGF 165双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带，经BDNF/NotⅠ双酶切后可见 IRES-VEGF 165基因片段，经 Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后可见BDNF-IRES-VEGF165基因片段。RT-PCR 与Western-blot 方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实，实验成功构建了人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。 -
人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定
背景:人向血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用.病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法.目标:构建双基因共表达载体plRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定.方法:是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到plRES2-EGFP多克隆位点构建成为plRES2-LIF-EGFP.人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从plRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入plRES2-LIF-EGFP中,后构建成为含有IRES(即内部核糖体进入位点)的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体.通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达.结果与结论:DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp.构建的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/Notl双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/ Notl双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段.RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白.结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体.
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丙型肝炎病毒与肝癌
一、HCV的基因结构及其产生的病毒蛋白HCV基因是由9500碱基构成的单链RNA病毒.该病毒基因组两端附有非翻译区(UTR),依含有5′UTR的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site,IRES)起动帽非依赖性翻译.本基因组中存在单一的长转录开放读框(ORF),于产生前体蛋白之后,继而通过加工形成不同的蛋白(图1).此包括构成病毒颗粒的蛋白即结构蛋白(核心、E1、E2及p7)和除此之外的非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B).
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口蹄疫病原免疫学的分子基础
FMDV属于微RNA病毒科,口蹄疫病毒属成员,是一种单股正链RNA病毒.基因组长度约为8 500 nt, 5'端共价连接一种特殊的小蛋白VPg(3B),其后为一个约1 300 nt的5'非编码区,与宿主RNA相比,FMDV的5'非编码区没有帽子结构,而是靠一个内部核糖体进入位点(IRES)启动基因组的复制;3'端含有poly(A)的尾巴,尾巴上游为100 nt的非编码区.5'非编码区和3'编码区之间为一个大约7 500 nt 的开放阅读框(ORF),编码一个2 300 aa多聚蛋白,这个多聚蛋白在感染细胞中或体外翻译体系从未发现,因为其被病毒编码的蛋白酶迅速裂解,这个蛋白酶也存在于多聚蛋白中.
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HBsAg与GM-CSF基因双表达载体的构建及其免疫效果
目的 构建乙型肝炎表面抗原基因(HBsAg)与GM-CSF基因的双表达载体,提高乙肝病毒DNA疫苗的免疫效果.方法 将微小病毒内部核糖体进入位点(IRES)基因克隆到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将HBsAg基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点处,构建双表达载体pHIG.将pHIG转染到COS-7细胞中,检测瞬时表达情况,并用双表达质粒pHIG免疫BALB/c小鼠,检测免疫后小鼠血清中抗-HBs及其脾脏细胞表面CD4+、CD8+分子的数量.结果 在转染pHIG质粒的COS-7细胞上清液中有HBsAg的表达,pHIG双表达质粒组比pVAX/HBs组抗体产生时间提前2周,抗体阳转率提高2倍,小鼠脾脏T细胞表面CD4+分子数量及CD4+/CD8+值均高于pVAX/HBs组.结论 HBsAg与GM-CSF基因双表达质粒能引起小鼠特异性免疫应答,并可提高免疫效果.
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pIRES2-GDNF-NT-3真核表达载体的构建与鉴定
目的:采用一种简便和高效的方法构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-NT-3.方法:人胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3是采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取,将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP.神经营养素3 cDNA片段通过替换EGFP的方式插入到pIRES2-GDNF-EGFP中构建成为pIRES2-GDNF-NT-3双基因共表达载体.结果:人胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3被克隆,通过测序和酶切鉴定的得知与基因库报道序列一致.结论:人神经生长因子和神经营养素3双基因真核表达载体成功构建,它提供了一个新的表达系统,为进一步研究双基因的功能奠定了基础.
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丙型肝炎病毒5′-非编码区及其结合蛋白的研究进展
丙型肝炎病毒(HCV)RNA5′-非编码区(5′-NTR)由341个核苷酸组成,形成4个茎-环二级结构,5′-NTR二级结构及某些部分单链序列的核苷酸组成是病毒翻译起始的先决条件.5′-NTR中的大部分核苷酸序列组成内部核糖体进入位点(IRES),在宿主细胞蛋白质因子La自身抗原、eIF3、多聚嘧啶区结构蛋白(PTB)、多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP-1、2)等的作用下,形成复杂的翻译起始复合物,对HCV的翻译过程进行精确调控,完成帽状结构形成非依赖性的蛋白翻译过程.HCV RNA 5′-NTR翻译过程的分子生物学机制的研究,将有助于HCV治疗新方法和新途径的探索.
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人NKG2A、CD94的基因克隆和真核共表达载体的构建
目的 构建真核共表达载体pNKG2A-IRES-CD94.方法 提取人外周血淋巴细胞总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增NKG2A、CD94基因,分别克隆pMD-NKG2A、pMD-CD94,对克隆基因进行DNA序列分析.pMD-CD94经XbaⅠ和Sal Ⅰ酶切,插入相应酶切的真核表达载体pIRES(多克隆位点B),NKG2A经XhoⅠ和Mlu Ⅰ酶切,插入相应酶切的pIRES-CD94(多克隆位点A).结果 扩增的DNA片段和预期的人NKG2A和CD94大小一致;DNA序列分析显示,克隆的基因序列和GenBank数据库中人NKG2A和CD94基因序列一致.酶谱分析显示,NKG2A和CD94正向插入表达载体pIRES.结论 成功构建了含人NKG2A和CD94的真核共表达质粒pNKG2A-IRES-CD94,为研究NKG2A和CD94基因的功能奠定了基础.
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靶向治疗肺癌双自杀基因HSV-TK/CD真核表达载体的构建
背景与目的:本研究构建CEA启动子和CMV增强子调控表达的HSV-TK和CD基因双顺反子真核表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD.方法:根据特异性引物PCR扩增获得CEA启动子(pCEA),巨细胞病毒的早期基因增强子(CMVE)序列,用基因重组的方法替换载体PIRES-EGFP通用启动子pCMV,得到重组质粒CMVE-PCEA-IRES-EGFP,转染重组质粒到表达CEA的肺癌细胞株中进行绿色荧光蛋白检测,确定启动子能有效启动报告基因在CEA阳性的肺癌细胞中的表达.用PCR扩增得到目的基因HSV-TK和CD,将目的基因HSV-TK和CD亚克隆到载体CMVE-pCEA-IRES-EGFP上,得到自杀基因HSV-TK/CD双表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD.结果:经酶切、PCR及DNA测序鉴定,双自杀基因真核表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD已成功构建,嵌合启动子CMVE-pCEA调控下能启动下游报告基因在CEA阳性的肺癌细胞株的表达.结论:成功构建了嵌合启动子CMVE-pCEA启动的双自杀基因HSV-TK/CD真核表达载体,为下一步研究双自杀基因对于CEA阳性表达的肺癌的治疗奠定了基础.
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质粒表达载体pIRES-CD的构建及其在ACC-2细胞中的表达
目的:克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因.构建质粒表达载体pIRES-CD,并利用该载体转染ACC-2细胞,建立稳定表达大肠杆菌CD基因的ACC-2细胞克隆.方法:通过PCR从大肠杆菌DH5α DNA中扩增出CD基因全长序列,将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中,进行序列测定.测序正确后,将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的CD基因的质粒表达载体pIRES-CD,采用电穿孔法,以质粒表达载体转染ACC-2细胞,用400μg/mL的G418筛选10d,获得稳定表达CD基因的ACC-2细胞系.提取该细胞的总RNA,用RT-PCR检测CD基因的表达.结果:PCR扩增出1280bp大小的片段,测序结果与GeneBank报道的CD序列基本一致:阳性重组质粒pIRES-CD经XbaI和NotI双酶切后,获得6.1kb和1280bp的片段;RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出228bp的预期片段.结论:成功扩增了CD基因的DNA片段;成功构建了质粒表达载体pIRES-CD;建立了稳定表达CD基因的ACC-2细胞系,为CD/5-FC自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定了基础.
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以内部核糖体进入位点序列连接两个独立表达基因构建重组腺病毒双表达载体
目的:以内部核糖体进入位点(IRES)序列连接鼠TGF-β1和PLP-Ig 2基因,构建重组腺病毒双表达载体.方法:采用常规分子生物学方法,分别从Con A刺激的小鼠脾细胞和WT-1杂交瘤细胞抽提总RNA,克隆鼠TGF-β1基因和Ig重链Fc基因;将编码PLP139-151的DNA与信号肽设计在引物上,经过2次克隆,形成PLP-Ig.与TGF-β1以IRES序列相连接后,经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接,鉴定后在HEK 293细胞包装.获得高滴度病毒后,采用ELISA方法鉴定TGF-β1基因的表达;Western印迹鉴定PLP-Ig的表达.结果:该双表达重组腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;病毒感染细胞分别经ELISA和Western印迹检测后证实TGF-β1和PLP-Ig得到了独立表达.结论:构建的可调控性鼠TGF-β1和PLP-Ig重组腺病毒双表达载体的独立表达,为后续基因治疗研究奠定了基础.
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利用细菌内同源重组技术构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体
目的 构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体,终获得胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入小鼠,为胰岛β细胞功能研究提供良好的基因敲除动物模型.方法 以低拷贝质粒pBR322-2s为骨架构建取获载体(retrieving vector),应用λ噬菌体Red重组酶介导的缺口修复(gap-repair)方法,通过细菌内的同源重组克隆长度约为12 kb的小鼠胰岛素2(Ins2)基因组DNA,同时构建1个带有内部核糖体进入位点(IRES)序列、Cre重组酶序列和正负向筛选标记基因的微型打靶载体(mini-targeting vector),后通过同源重组获得Ins2-Cre打靶载体.结果 以Ins2基因的第3外显子为靶点,成功构建了受内源性Ins2基因启动子严格调控的表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体.结论 成功构建了在胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体,为获得胰岛β细胞中基因特异性敲除小鼠模型提供了关键材料.
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一个包含HCV IRES的高效真核双顺反子表达载体的构建
目的利用丙型肝炎病毒(HCV)的内部核糖体进入位点(IRES)元件构建一个新的真核双顺反子表达载体.方法克隆包含HCV 5'非编码区18nt开始到HCV CORE区编码基因的32nt的IRES序列替换商用载体pIRES中脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES序列,构建真核双顺反子表达载体pCVIR,再将绿色荧光蛋白(GFP)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因分别克隆到pIRES和pCVIR中的IRES的上下游,用流式细胞仪检测GFP的表达强度,ELISA法检测HBsAg的表达,比较两者的表达效率.结果pCVIR载体对IRES下游GFP和HBsAg的表达效率高于pIRES载体.结论构建了一个高效的真核双顺反子表达载体.
