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应用同源重组技术构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型打靶载体的策略
目的 构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型基因敲入打靶载体,模仿低血钾周期性麻痹患者中的对应发现.方法 采用置换型载体,分为长短、短臂设计(1.5～2.0 kb),以便用聚合酶链反应(PCR)方法筛选中靶载体和ES细胞(embrgonic stem cell).首先以Cchl1a3基因为模板设计引物,并引入与质粒内插入位点酶切序列相配的内切酶序列,扩增用于套取的同源臂a和b,以及用于插入筛选基因和实行定点突变的同源臂c和d,c和d首尾相接,用点突变特异性PCR在c内实现R528H突变.将a和b定向插入pBR322,借助于温度敏感的pSC101-BAD-gba-(tet)质粒的表达Red/ET重组酶,使其与携带Cchl1a3基因的细菌人工染色体(BAC)实现同源重组,套取含目的突变点、长约8 kb的Cchl1a3的基因片断,形成pBR322-Cchl1a3.将c和d定向插入PL451质粒Frt-Neo-Frt片段两侧,酶切c-Frt-Neo-Frt-d片断纯化后,再与pBR322-Cchl1a3质粒一同转入含Red/ET重组酶基因的大肠杆菌EL250菌株,在重组酶的催化下再次实现同源重组,在Cchl1a3基因的给定位点实现R528H突变并插入包含筛选基因和重组酶识别位点的Frt-Neo-Frt片断,完成载体的构建.载体构建过程中,酶切位点变化导致的片断程度改变作为初筛,PCR产物测序结果作为后的鉴定依据.结果 打靶载体符合设计要求.结论 运用点突变特异性PCR,结合Red/ET重组技术构建基因定点突变的基因敲入型打靶载体,在重组酶催化下仅需要2次同源重组即可完成.该策略成熟简便,省时省力,构建的载体易于鉴定.
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人CCL20基因打靶载体的构建与鉴定
目的:构建针对人CC亚族趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20,CCL20)基因外显子2的置换型打靶栽体.方法:设计和合成引物,利用长距离聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)从永生化人角质形成细胞系(HaCaT)基因组DNA中克隆出CCL20基因组DNA片段,再以CCL20基因为模板扩增出长度为1969 bp的同源短臂和2356 bp的同源长臂.分别插入pioxP栽体的Neo基因上游和下游,构建针对人CCL20基因外显子2的置换型打靶载体(ploxP-hCCL20).将打靶载体线性化并以电穿孔方法转移入HaCaT,观察克隆的形成.结果:经过PCR、限制性内切酶鉴定及DNA序列测定.证实该载体的两条同源臂包含人CCL20基因的外显子1、3、4及其邻近的部分内含子.结论:ploxP-hCCL20载体构建成功,增加Neo基因下游同源臂长度的策略有可能提高细胞基因敲除的同源重组率.
关键词： 人 CC亚族趋化因子配体20 打靶载体 序列分析 -
利用细菌内同源重组技术构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体
目的 构建胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶的基因敲入打靶载体,终获得胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入小鼠,为胰岛β细胞功能研究提供良好的基因敲除动物模型.方法 以低拷贝质粒pBR322-2s为骨架构建取获载体(retrieving vector),应用λ噬菌体Red重组酶介导的缺口修复(gap-repair)方法,通过细菌内的同源重组克隆长度约为12 kb的小鼠胰岛素2(Ins2)基因组DNA,同时构建1个带有内部核糖体进入位点(IRES)序列、Cre重组酶序列和正负向筛选标记基因的微型打靶载体(mini-targeting vector),后通过同源重组获得Ins2-Cre打靶载体.结果 以Ins2基因的第3外显子为靶点,成功构建了受内源性Ins2基因启动子严格调控的表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体.结论 成功构建了在胰岛β细胞中特异性表达Cre重组酶的基因敲入型打靶载体,为获得胰岛β细胞中基因特异性敲除小鼠模型提供了关键材料.
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利用PCR产物快速构建兔HPRT 基因无启动子打靶载体
目的 探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法,为下一步获得兔 HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础.方法 首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12.5 kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-rHPRT质粒.然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒,通过PCR的方法获得两个不同的带有50 bp HPRT 基因同源序列的IRES-eGFPCre-Frt/Neo/Frt同源重组片段,终构建 HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.结果 PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,表明载体构建成功.结论 成功快速地构建了HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究.
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小鼠bcl10基因敲除载体的构建
根据已知的cDNA序列设计引物,通过RT-PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针,用噬斑原位杂交法克隆129品系小鼠的bcl10基因组DNA,在亚克隆完成序列结构分析的基础上,利用常规分子克隆技术,构建完成了针对bcl10基因的替代型基因敲除载体.两条同源臂分别为bcl10基因exon3上游2.4 kb和exon4下游4.5kb的基因片段.构建完成替代型小鼠bcl10基因敲除载体,为后续获得bcl10基因缺陷型胚胎干细胞系奠定了实验基础.
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食管癌细胞Eca9706 DNA聚合酶β基因敲除载体的构建
目的：构建食管癌细胞Eca9706 DNA聚合酶β（ DNA polβ）基因敲除载体，为DNA polβ基因敲除奠定基础。方法应用体细胞基因敲除技术的方法和原理，根据DNA polβ基因序列，设计并合成2对特异性引物（UP1/UP2和DOWN1/DOWN2），通过PCR扩增获得上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN），其中上游同源序列长1268 bp，下游同源序列长2150 bp，将其插入骨架载体pcDNA3.1，从而构建了DNA polβ基因敲除载体pOUT-polβ，后用PCR、酶切和测序进行鉴定。结果经过PCR筛选，限制性酶切及DNA测序鉴定，证实上游同源序列（ UP）和下游同源序列（ DOWN）2个片段插入正确。结论通过本研究所述方法，成功构建了用于食管癌细胞Eca9706 DNA polβ基因敲除载体pOUT-polβ。
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小鼠T279基因敲除胚胎干细胞的构建
目的:利用打靶载体技术构建小鼠T279基因敲除胚胎干细胞模型.方法:订购含小鼠T279基因的129 BAC质粒和PL452,PCR扩增Retrieving同源臂及loxp-neo-loxp片段,利用PL253质粒进行目的片段的连接,并在EL350大肠杆菌中进行同源重组,构建T279打靶载体,将其电转染小鼠胚胎干细胞,利用Southern blot方法鉴定同源重组的阳性克隆.结果:经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序鉴定,T279打靶载体构建成功.Southern blot结果显示成功筛选到同源重组的敲除T279基因的胚胎干细胞克隆.结论:T279基因敲除打靶载体构建成功并筛选到了同源重组阳性的胚胎干细胞克隆.
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小鼠TSC21基因敲除打靶载体的构建和胚胎干细胞同源重组克隆的鉴定
目的:构建小鼠TSC21基因敲除打靶载体,电转胚胎干细胞(ES细胞)并筛选同源重组阳性克隆.方法:订购含TSC21基因的129 BAC克隆,PCR扩增2对同源臂,利用PL253、PL452质粒进行目的片段的连接和同源重组,构建打靶载体并电转ES细胞,利用Southern blot方法鉴定同源重组阳性ES细胞克隆.结果:构建了TSC21基因敲除打靶载体,经过限制性内切酶鉴定及DNA测序鉴定,TSC21基因敲除打靶载体构建成功.Southern blot结果显示成功筛选到打靶序列同源重组阳性ES细胞克隆.结论:TSC21基因敲除打靶载体构建成功并筛选到同源重组阳性ES细胞克隆.
