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HCV IRES介导荧光素酶小鼠体内表达模型的建立
HCV内部核糖体起始位点 (internal ribosomal entry site, IRES)含有40S核糖体的有效结合部位和与内部翻译起始因子eIF-3的结合部位,以内部起始方式调控介导HCV蛋白的翻译启动,在翻译调控中具有重要作用[1],是反义寡核苷酸、核酶和siRNA等药物治疗的重要靶位.王小红等[2]曾构建了CMV启动子启动转录的HCV IRES调控荧光素酶表达载体pHCV-neo4,建立了转基因细胞模型.获得了在细胞水平上对HCV有明显抑制作用的反义寡核苷酸.而在动物水平上的评价却无合适的模型.我们进一步采用水动力转染法将pHCV-neo4表达载体转染到小鼠体内,在小鼠肝脏检测到荧光素酶的高水平表达,可作为体内瞬时评价以HCV IRES为靶位的抗HCV药物活性的小鼠模型.
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Stat1基因真核表达质粒的构建及其体外转染和表达检测
目的 克隆信号转导与转录活化子1(signal transducer and activators of transcription,STAT)基因片段并构建其真核重组表达质粒.通过研究Stat1 mRNA序列各组成部分与Stat1基因翻译调控的关系,探讨了Stat1蛋白翻译调控机制.方法 采用DNA重组技术,将用SMART RACE法筛选出的Stat1基因片段克隆到pT-Adv载体,然后将其亚克隆到pFLAG-CMV-2真核表达载体上,构建Stat1 cDNA重组质粒.分别采用磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法和脂质体介导转染法将其转染Hela细胞,并时3种方法的转染效率及各重组Stat1质粒mRNA和蛋白质表达的差异进行比较,以研究Stat1 mRNA结构对Stat1表达的影响.结果 构建了CS,C3S,CS/3S,5SFC3S,5SFCS和CL/3L共6个重组Stat1质粒.通过比较发现,磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法的转染效率明显低于脂质体介导转染法,转染的质粒均得到清晰的mRNA和蛋白质表达信号.用INF-α刺激转染5SFC3S重组Stat1质粒的Hela细胞,发现刺激组与空白组Stat1 mRNA转录水平和蛋白质表达量无明显差异,蛋白质合成效率无降低,此结果与野生型Stat1对INF-α刺激不同.结论 将重组Stat1质粒转染Hela细胞后,在短暂表达条件下,重组Stat1质粒与野生型Stat1对INF-α刺激反应不同,其原因尚有待进一步研究.
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卵巢恶性肿瘤的蛋白质组学研究现状与展望
1995年,Wasinger等[1]发表在Electrophoresis的文章中首次使用了由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年提出的蛋白质组(proteome)的概念,这标志着蛋白质组学(proteomics)的诞生.这一全新学科的诞生有着深刻的时代和科学发展的背景.随着人类基因组计划的顺利完成,生命科学研究已进入了后基因组时代.由于基因只是遗传物质的载体,蛋白质才是生理功能的执行者;基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化,而真正发挥功能的蛋白质要经过转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等许多步骤和调控才能形成;因此,对基因组的研究有时并不能完全反映机体功能的变化,为了减少这种客观存在的相对误差,蛋白质组学作为快捷、有效的蛋白质分析技术应运而生.
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霍乱毒素A、B亚基基因比例表达的精确调节
目的:研究霍乱毒素A亚基基因内部翻译起始序列的翻译起始效率与A亚基基因翻译起始效率的关系.方法:将基因内翻译起始序列合成后克隆到上游含有起始密码和无起始密码的报告质粒中,研究表达水平的差异.结果:在上游翻译起始区(translation initiation region,TIR)与报告基因间插入该序列,基因的表达水平提高1倍;当上游的翻译起始密码由ATG突变为ATC时,内部翻译起始序列几乎失去翻译起始功能.结论:TIR-1的翻译起始效率与上游起始序列的起始效率相同;且受上游翻译起始序列的精确调控.
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死亡相关蛋白5研究进展
蛋白质生物合成是遗传信息的翻译过程,包括起始、延伸和终止3个阶段,其中起始阶段是调控的关键.死亡相关蛋白5是新近发现的翻译调控因子,能够调控真核生物mRNA依赖5'帽状结构翻译及经内部核糖体进入位点途径翻译的起始.随着研究的深入,发现死亡相关蛋白5在细胞分化及凋亡等病理生理过程中具有重要作用.本文就近年来死亡相关蛋白5研究进展作一综述.
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大鼠骨骼肌雷帕霉素靶蛋白mRNA表达与4周耐力运动的影响
背景:已有研究提示,雷帕霉素靶蛋白信号调控骨骼肌蛋白翻译过程,在运动引起的蛋白质合成变化中起作用.目的:观察耐力运动对骨骼肌雷帕霉素靶蛋白mRNA表达的影响,以及雷帕霉素靶蛋白在运动诱导骨骼肌生长中的作用途径.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-10/12北京体育大学运动人体科学学院实验室完成.材料:健康雄性、SPF级2月龄的SD大鼠12只,体质量180～200 g,随机为运动组和对照组,每组6只.方法:运动组先进行适应性训练:上坡跑,坡度为5°,速度分别为10,15,20 m/min强度递增的跑台运动,30 min/次, 1次/d,共6 d;然后进行正式运动:上坡跑,跑台坡度5°,速度20 m/min,60 min/次,1次/d,6 d/周,共4周的跑台运动.②对照组均不运动,其他生活条件与运动组相同.主要观察指标:采用反转录-聚合酶链反应方法测定腓肠肌雷帕霉素靶蛋白mRNA表达,采用BCA方法测定腓肠肌总蛋白含量.结果:实验纳入的12只大鼠全部完成训练,均进入结果分析,中途无脱落.①运动组腓肠肌总蛋白含量显著高于对照组 (67.0±11.7, 46.8±7.9;P < 0.05).②运动组雷帕霉素靶蛋白表达量显著高于对照组表达量(0.43±0.04, 0.25±0.03;P < 0.05).结论:耐力运动后大鼠腓肠肌总蛋白含量上升,骨骼肌雷帕霉素靶蛋白mRNA表达上升,提示雷帕霉素靶蛋白可能参与肌肉生长对运动适应的调控.
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eIF3a与肿瘤发生、演进和干预的研究进展
真核翻译起始因子3(Eukaryotic translation factor 3,eIF3)是由多个亚单位组成的复合因子,其中eIF3a是其大的亚单位.很多研究表明在酵母和哺乳动物细胞中,eIF3都参与了mRNA翻译起始,并对蛋白质的合成有很好的调控作用.值得一提的是eIF3a通过调控一系列与肿瘤的生成、细胞周期的调控DNA修复等过程相关的mRNA的翻译从而在肿瘤的发生、演进和干预中发挥重要作用.此外,研究发现eIF3a对RAF-MEK-ERK信号通路有抑制作用.eIF3a对蛋白质翻译的调节及其对RAF-MEK-ERK信号通路的影响使其有望成为肿瘤治疗的新靶点.本文将着重围绕eIF3a在肿瘤发生、演进和干预中的作用进行概述.
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翻译调控者eIF3a：复杂的eIF3亚基
基因表达调控是细胞生理的一个基本步骤，它的异常可能会导致细胞的无限生长和癌症。mRNA的翻译，其主要的调节步骤是限速起始步骤，许多真核翻译起始因子(eIFs)参与其中。大复杂的起始因子是eIF3，它在翻译调控，细胞生长和癌症发生中都起了一定的作用。eIF3大的亚基是eIF3a，它在所有组织不同程度的表达，并且发现在许多癌症组织中高表达。eIF3a可以调节细胞周期，可能是蛋白质进入S期的翻译调节器。在分化细胞内eIF3a的表达减少，并且抑制它的表达可以扭转细胞的恶性表型和改变细胞周期调节剂的敏感性。然而，eIF3a在癌症发生中所起的作用仍不清楚。但研究证明其参与了癌症的发展并能阻止肿瘤的恶性进展。
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翻译起始的调控与肿瘤靶向基因治疗
真核细胞主要通过高度结构化的5'端非翻译区(5' untranslated region, 5'UTR)实现mRNA翻译起始的调控,其主要作用方式有3种,即通过本身高度复杂的二级结构在空间上阻碍翻译起始、通过其包含的上游AUG密码子(uAUG)和上游开放阅读框(uORF)元件来抑制翻译起始,以及通过其包含的内部核糖体进入位点(IRES)元件的"非帽依赖"(cap-indepen-dent)起始途径来抑制翻译起始.肿瘤细胞通常会过表达真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E)、 eIF4A、eIF4G等,这些因子可以通过解开5'UTR的复杂结构特异性地解除5'UTR的翻译抑制作用.目前应用5'UTR进行肿瘤靶向性基因治疗的思路是把肿瘤杀伤基因置于5'UTR调控之下,利用肿瘤细胞过表达翻译起始因子来发挥5'UTR在肿瘤细胞中的翻译竞争优势,实现治疗基因在肿瘤细胞中的特异性表达,从而达到靶向杀伤肿瘤的目的.
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eIF4E及其相关肿瘤靶向治疗研究进展
eIF4E是一类在真核细胞翻译起始中发挥重要作用的分子,对蛋白质翻译具有调控作用.eIF4E在多种肿瘤细胞中高表达,可在翻译水平上调多种与肿瘤密切相关的蛋白质分子的表达.利用eIF4E对蛋白的翻译调控机制进行肿瘤靶向治疗得到了深入研究和成功应用,本文就eIF4E的翻译调控机制及其相关的肿瘤靶向治疗进展进行综述.
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eIF3a的生物学功能及其对肿瘤化疗的影响
真核生物翻译起始因子3a(eukaryotic initiation factor 3a,eIF3a)不仅在翻译起始阶段起着重要的调控作用,还影响着细胞周期以及细胞的分化.研究发现eIF3a在多种肿瘤组织中高表达,它不仅对肿瘤的发生发展起着重要的调控作用,还可以影响化疗的疗效以及在化疗过程中产生的副反应.本文对eIF3a的结构,功能以及它对肿瘤化疗的影响进行综述.为研究eIF3a作为一种新型的生物标记物奠定基础.
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翻译起始因子与肿瘤翻译调控异常研究进展
蛋白合成是维持细胞稳态和细胞增殖的关键步骤.翻译过程的调控多发生在蛋白合成起始过程,多种翻译起始因子(eIFs)参与此过程.在细胞恶性袁型转化过程中,常伴随这些因子的磷酸化、过表达及降解过程异常.如帽结合蛋白eIF4E高表达,甲硫氨酸-tRNA结合蛋白eIF2过度活跃,eIF3的活性增高等现象.eIFs在蛋白合成及细胞增殖过程中的重要地位使得其成为抗肿瘤研究的热点及潜在的治疗靶点.本文对eIFs及肿瘤翻译调控的研究进展及研究方法进行综述.
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蚊虫细胞色素P450基因系列研究
报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近5年来有关蚊虫细胞色素P450基因(CYP450)系列研究结果,包括:①通过简并引物PCR分别从致倦库蚊、白纹伊蚊及中华按蚊中获得3个、2个、2个CYP4家族成员基因片段;通过简并引物PCR及RT-PCR从白纹伊蚊中获得16个CYP6家族成员基因片段;②利用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得了白纹伊蚊CYP6家族3个新的全长cDNA序列及7个超过其全长一半以上的cDNA序列.GenBankaccessionnumber分别为AF283836-AF283838(全长cDNA序列)和AF284782-AF284783(非全长cDNA序列),被国际P450命名委员会正式命名为CYP6N3v1-v3(全长cDNA序列)和CYP 6N3v4、CYP6N4v1-v6,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中;③运用基因步移方法从白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP6N3上游3 076 bp调控序列;④对白纹伊蚊CYP 6N3、CYP6N4非翻译区序列功能分析显示:昆虫CYP450与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似,但具有多态性的特点;⑤对白纹伊蚊CYP6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示:蚊虫中CYP450转录起始存在着复杂性;⑥证实蚊虫中CYP6存在多样性,并分析讨论了此种多样性形成的可能机制;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P450 CYP6家族分子进化机制;⑧阐明了下一步研究的目标.
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肝癌干细胞中 microRNAs 的功能研究进展
研究表明，肿瘤组织中存在极少量具有无限增殖、自我更新、放化疗耐受以及高致瘤能力并具有干细胞特性的肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs），其比例与肿瘤的恶性程度呈正相关［1］。随着CSCs在不同肿瘤组织被发现，在肝癌中也被证实存在极少量干细胞特性的肝癌干细胞（ hepatic cancer stem cells，HSCs），并且证实是导致肝癌发生、发展、转移、复发和耐药的重要原因。 microRNAs（ miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的短链非编码RNA，可通过降解mRNA或抑制mRNA翻译调控众多基因的表达，在胚胎的发生、组织器官发育、细胞生长分化与凋亡、疾病发生发展以及CSCs的维持等一系列生命活动中发挥着重要作用［2-5］。目前已确认 miRNAs 与 CSCs 密切相关，研究特定miRNAs在肝癌发生、发展及其在HSCs中的作用正成为肝癌研究新热点，miRNAs将是治疗肝癌的新靶点。
