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肠道病毒71型2C蛋白的异源表达及纯化
目的 获得高纯度、性状均一的可溶蛋白肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)2C. 方法 截取2C蛋白的6个包含ATPase/解旋酶等核心结构域的基因片段,分别使用含有His标签和MBP促溶标签的表达载体在大肠埃希菌中进行异源表达,分子筛层析纯化2C蛋白,SDS-PAGE电泳检测表达产物和纯化蛋白. 结果 成功将EV71 2C蛋白的6个片段进行了克隆表达并纯化,获得了高纯度、性状稳定的可溶蛋白MBP-2C 91aa-256aa和MBP-2C 118aa-256aa.SDS-PAGE检测2C蛋白纯度达97％以上,分子质量与预期结果一致.纯化的2C蛋白浓度为8.8 mg/ml. 结论 91aa-256aa和118aa-256aa片段的MBP-2C截短蛋白比包含其他片段的截短蛋白性状稳定、均一,MBP标签提高了2C的6个截短蛋白的可溶性.高纯度可溶蛋白的制备为其晶体结构和功能研究奠定了基础.
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幽门螺杆菌定植因子HpPrtC胶原蛋白酶的异源表达及其功能活性研究
目的 异源表达幽门螺杆菌HpPrtC胶原蛋白酶,并检测其对胶原蛋白的降解活性. 方法 根据幽门螺杆菌基因组信息中编号hp0169基因的序列设计引物,PCR扩增HpPrtC基因的核苷酸序列,经NdeⅠ和XhoI酶切后构建原核表达载体pET 22b(+)-HpPrtC,转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用亲和层析法纯化重组蛋白,通过检测重组酶处理胶原蛋白后L-亮氨酸的产生量表征其胶原蛋白降解活性. 结果 HpPrtC基因编码422个氨基酸,与已知PrtC家族蛋白酶氨基酸序列比对高相似性＜40％.克隆HpPrtC基因连接入表达质粒pET-22b(+),将测序正确的表达质粒pET-22b(+)-HpPrtC转化至感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达相对分子质量约为47×10 3的可溶性蛋白,与预期相符.经亲和层析纯化后的重组蛋白酶降解热变性Ⅰ型胶原蛋白(可溶、不可溶)和天然Ⅰ型胶原蛋白的活性分别为922.2±36.2、1168.8±65.6和674.0±13.4,与幽门螺杆菌培养液中胶原蛋白酶对可溶热变性Ⅰ型胶原蛋白、不可溶热变性Ⅰ型胶原蛋白和天然Ⅰ型胶原蛋白活性分别为205.6±21.5、228.4±19.3和123.2±14.5-致. 结论 幽门螺杆菌定植因子HpPrtC为胶原蛋白酶.通过大肠埃希菌异源表达的重组HpPrtC蛋白具有胶原蛋白酶解活性,为探索该酶在幽门螺杆菌感染定植中的作用机制奠定了基础.
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白蚁内源性纤维素酶基因的异源表达
作为含量多的生物质,纤维素是地球上储量大的可再生资源.酶解纤维素是高效转化木质纤维素类生物质生产生物乙醇的重要途径.食木性白蚁是纤维素消化率高的昆虫,其唾液腺组织和中肠细胞都能分泌纤维素酶.该文从白蚁的内源性纤维素酶——内切-β-1,4-葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(BG)的分泌情况着手,综述了其编码基因EG(GHF9)和BG(GHF1)的异源表达研究进展,为进一步挖掘和研究白蚁体内丰富的纤维素酶基因提供了有益的背景信息和思路.
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抗肿瘤环肽YM-216391在异源宿主中的生物合成
目的 筛选链霉菌宿主并异源表达环肽YM-216391,为组合生物合成新化合物等后续研究奠定基础.方法 将包含YM-216391合成整个基因簇的黏粒导入不同的链霉菌中,分析不同宿主YM-216391表达量,并探索培养基配方.结果 YM-216391在白色链霉菌(Streptomyces albus),变铅青链霉菌(S.lividans 1326,S.lividans TK24)和金色链霉菌苏州变种(S.aureus var.suzhouensis var.Yen SP-371)宿主中均可实现异源表达,通过优化培养基配方,YM-216391表达量达到(5.664±1.176) mg/L.结论 YM-216391在不同链霉菌宿主中均可表达,其中在S.albus中表达量高.
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Sansanmycin生物合成基因簇在天蓝色链霉菌中的异源表达
Sansanmycins (SSs)是一类由Streptomyces sp. SS产生的尿苷肽类抗生素,具有抗结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌活性.该类化合物主要是由4',5'-烯胺-3'-脱氧尿苷通过肽键与假四肽肽链中的N-甲基-2,3-二氨基丁酰基(DABA)相连.为了研究相关基因的功能,进一步利用合成生物学的手段获得SSs的新结构衍生物,本实验克隆了完整的SS生物合成基因簇,并将其在天蓝色链霉菌M1146、M1152和M1154中异源表达.借助于HPLC和LC-HRMS/MS等对重组菌株的发酵液进行分析,结果表明三株异源表达菌株均能产生SS-A,而且M1154异源表达菌株的SS-A产量与未退化的野生型菌株相当.同时从M1154异源表达菌株发酵液中发现了一个可能为新结构的SS类似物SS-1154.
关键词： 异源表达 天蓝色链霉菌 sansanmycin类似物 -
依地福新诱导异源表达人凋亡基因的酿酒酵母细胞的凋亡
酵母作为一种容易进行操作的生物模型,广泛应用于异基因表达和结构与功能的研究中[1].尽管它们可能缺乏某些与高等生物相似的凋亡调节因子的同功异构体,但在某些生理情况下(如突变体、乙酸处理等)或在异源表达哺乳动物促凋亡基因时,可观察到细胞的凋亡.
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太子参鲨烯环氧酶基因的克隆及其表达分析
目的 对太子参三萜类皂苷生物合成关键调控酶鲨烯环氧酶1 (SQE1)基因进行全长cDNA克隆和功能分析.方法 基于其他植物SQE基因的同源序列设计简并引物,以太子参块根总RNA为模板,RT-PCR结合RACE技术克隆太子参SQE1基因的全长cDNA,并进行生物信息学分析.利用农杆菌叶盘转化法将SQE1基因转化烟草,研究其对烟草总三萜量的影响.结果 获得太子参SQE1基因全长cDNA序列2 038 bp,该序列包含1 554 bp的开放阅读框,编码517个氨基酸,相对分子质量为5.67×104,等电点为8.8,与其他药用植物的SQE蛋白具有较高的同源性,含有FAD结合结构域和4个跨膜区域,转太子参SQE1基因的烟草的总三萜量明显高于非转基因植株.结论 首次克隆获得太子参SQE1基因的全长cDNA,该基因的异源表达可一定程度提高转基因植物的总三萜量,为阐明与应用太子参三萜类成分生物合成途径提供科学依据.
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短乳杆菌DM9218肌苷水解酶基因的异源表达及活性检测
目的 探讨短乳杆菌DM9218肌苷水解酶基因A0008的异源表达及其对肌苷的分解活性检测.方法 克隆来源于短乳杆菌DM9218基因组的肌苷水解酶基因A0008,构建原核表达载体,转入大肠埃希菌BL21诱导重组蛋白表达并纯化,进行体外酶活检测.结果 成功构建了肌苷水解酶A0008-pET28a原核表达载体,表达并纯化出重组蛋白,酶活结果显示该重组蛋白具有水解肌苷的能力.结论 短乳杆菌DM9218基因A0008可能编码肌苷水解酶并参与DM9218对肌苷的分解.
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异源表达策略在抗生素研究中的应用进展
异源表达在抗生素研究中有广泛的应用,如鉴定基因功能、克隆抗生素合成基因、调节基因表达、提高抗生素产量、组合生物合成和发现活性代谢产物等各个方面.本文简单综述异源表达策略在抗生素研究中的应用进展.
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碳酸酐酶Ⅱ基因克隆及在毕赤酵母中的异源表达
碳酸酐酶Ⅱ（carbonic anhydrase Ⅱ, CA Ⅱ）是参与机体多种代谢活动和病理活动的一种重要催化酶。通过基因重组、电转化等方式，得到能异源高表达人 CA Ⅱ的毕赤酵母（Pichia. pastoris）GS115工程菌。对工程菌进行培养及甲醇诱导后，经离子交换层析柱分离纯化后得到较纯的重组 CA Ⅱ。通过 Western blotting、酶活力及圆二色谱检测发现重组和商品化 CA Ⅱ具有相似的酶活力和构象，为 CA Ⅱ今后进一步在临床的研究和工业应用打下了基础。
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赤子爱胜蚓蚓激酶的异源表达及重组酶性质初步研究
利用基因工程技术从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida) cDNA中克隆得到一条全长为738 bp的蚓激酶编码基因Eflk(GenBank登录号KY452025),其编码245个氨基酸,与粉正蚓(Lumbricus rubellus) F-III-2的核苷酸和氨基酸序列同源性高分别为96.21％和97.14％.利用生物信息学方法预测分析蚓激酶EFLK蛋白分子主要由β折叠结构组成,理论等电点(pI)为4.97,其活性中心为Arg15-Phe19-Pro20-Glu66-Asn113”,位于loop结构所形成的隧道结构中.将该基因与pPIC9k载体相连接后电击导入毕赤酵母GS1l5中得到重组表达菌株GS 115-pPIC9K-Eflk,重组菌株经甲醇诱导发酵72 h,发酵液中蚓激酶活力达到224.8u/ml.纯化后重组酶蛋白的比活力为4 545.84 u/mg,相对分子质量为2.7×104.酶学性质研究结果表明该酶的适pH值为8.0,在pH 5.0～9.0范围内催化活力较高;在低于40℃条件下该酶的催化活性较稳定.
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bgtfA在东方拟无枝酸菌中异源表达及其产物鉴定
在万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)中异源表达Balhimycin产生菌来源的糖基转移酶基因bgtfA,从而在工程菌发酵液中获得杂合万古霉素,以探索糖基转移酶BgtfA能否作为一个独立的元件在异源宿主中发挥催化作用.首先将bgtfA基因克隆至载体质粒pULVK2AE,构建重组质粒pLYEBA2AE,然后采用电转化方法将质粒导入东方拟无枝酸菌,用HPLC和LC-MS检测、验证工程菌发酵液中是否存在BgtfA的催化产物.成功地在东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)异源表达bgtfA基因,经HPLC和LC-MS检测分析,在工程菌的发酵液中获得预期的BgtfA催化产物,杂合万古霉素LYV07ww01.这表明BgtfA有一定的底物宽泛性,不仅能够催化表万古糖胺与balhimycin苷元的连接,还能催化万古糖胺连接至万古苷元.
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基因组学在放线菌次级代谢产物发现中的应用
放线菌产生的次级代谢产物是用于药物研发的新型活性化合物的重要来源,具有十分重要的历史地位.放线菌可以产生大量结构多样的天然产物,具有很多生物活性并且在临床上有广泛的应用,例如治疗传染病和癌症.基因组学研究表明放线菌在合成次级代谢产物方面要远比基因组测序时代之前传统筛选工作中检测到的潜力要大得多.然而,许多次级代谢产物生物合成基因簇在实验室培养条件下并不表达,放线菌的产次级代谢产物的潜力受到抑制.由于全基因组测序技术的不断发展,已经开发出了许多新的方法用以鉴定次级代谢产物合成基因簇.这些方法主要包括基因组筛选基因簇,克隆,并在异源宿主中进行高表达等几个方面.基因组学的快速发展重振了天然产物研究领域,尤其在放线菌天然产物研究上.文章主要回顾了一些放线菌基因组学的工具和方法,讨论了这些工具如何促使放线菌生产抗生素和其他次级代谢产物.
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万古霉素糖基转移酶GtfE的异源表达与体外活性检测
为了得到具有糖基转移酶活性的重组蛋白,从万古霉素产生菌总DNA中克隆万古霉素糖基转移酶基因gtfE,连入pET-37b构建表达质粒并转入大肠杆菌BL21(DE3)表达,体外测定纯化后的重组蛋白糖基转移酶活性,用HPLC和ESI-MS检测反应产物.结果表明,重组蛋白具有预期活性,可以催化尿苷二磷酸葡萄糖与万古霉素苷元的糖基化反应.本研究为获得糖基多样性的万古霉素奠定理论基础.
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临床分离MRSA中氨基糖苷类抗生素磷酸化酶的克隆表达与活性测定
目的:从临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中克隆氨基糖苷类抗生素磷酸化酶基因并异源表达,建立其磷酸化反应的体外测活方法.方法:考察临床分离MRSA对氨基糖苷类抗生素的敏感性,从中克隆磷酸化酶基因,并连入pET28a构建表达载体和菌株,将表达的重组蛋白以亲和色谱分离纯化;使用ESI-MS以及抗菌活性实验测定其磷酸化酶活性.结果:药敏实验表明临床分离的6株MRSA均对氨基糖苷类抗生素不敏感,重组表达克隆到的磷酸化酶,表达产物纯化后的纯度大于90%,体外催化试验表明,重组磷酸化酶2 h内可以催化反应体系内的卡那霉素B完全磷酸化.结论:异源表达的氨基糖苷类抗生素磷酸化酶具有很好的活性,体外测活方法可靠快捷,为建立氨基糖苷类抗生素磷酸化酶抑制剂筛选模型打下基础.
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人CYP的异源表达及其在新药研发早期的作用
人细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)在临床上对外源及内源性的物质代谢起着至关重要的作用.由于从人组织中获取的CYP成分较为复杂,且人组织本身不易获得,人们开始用各种表达系统来进行CYP的异源表达,并将表达得到的单一CYP用于药物代谢及药物-药物相互作用的研究,从而大大提高了药物高通量筛选的效率.另外,由于药物代谢酶的多态性使不同人群表现出对某种药物药效的差异,因此对某种CYP突变体的异源表达和药物代谢研究,将有助于指导治疗方案的优化,实施个体化药物治疗.
关键词： 细胞色素P450酶系统 异源表达 药物利用 药物设计 -
哺乳动物细胞色素P450在大肠杆菌上表达的研究进展
细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是人体内代谢各种内外源性物质重要的酶系之一.随着分子生物学和重组技术的飞跃发展,对哺乳动物来源的CYP450 cDNA进行精细操作并将使其在异源系统中表达成为可能.目前已经有多种异源系统被用来进行哺乳动物CYP450的表达,每一种系统都各具优缺点.哺乳动物CYP450在大肠杆菌上的表达是在实验室中的主要表达方式,但采用不同的方式表达的蛋白量不一样,而且对蛋白酶的活性也有着一定的影响;同时,蛋白纯化手段的选择也会影响CYP450表达方式的应用.本文拟对哺乳动物CYP450在大肠杆菌上的表达纯化现状和应用进行概述.
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华支睾吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因的原核表达及重组蛋白的功能鉴定
目的克隆肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因并在大肠杆菌内表达,同时对表达的重组蛋白进行初步的功能分析,为进一步的研究和药物筛选打下基础.方法通过大规模测序从肝吸虫cDNA文库中确定肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因,采用PCR方法扩增出目的片段,与表达质粒pGEX-4T-1连接构建重组质粒,IPTG诱导表达;研究重组蛋白的理化性质及酶动力学特征,并寻找可能的抑制剂.结果成功表达出约64 kDa的重组蛋白,凝血酶切后为36 kDa蛋白,其酶活性为63.6 U/mg.1.14 mM 4,4′-二甲氨基联苯甲醇处理30 min酶活性下降了60%;吡喹酮、灭滴灵和阿苯哒唑对酶活性无抑制作用;而5'-单磷酸腺苷对重组酶有竞争性抑制作用,其Ki为0.49.结论成功地表达了目的蛋白,为药物筛选提供了一个易于获得的候选蛋白分子.
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哺乳动物CYP450在大肠埃希菌上表达的研究进展
细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是人体内代谢各种内外源性物质重要的酶系之一.随着分子生物学和重组技术的快速发展,对哺乳动物来源的细胞色素P450 cDNA进行精细操作并将使其在异源系统中表达成为可能.目前已经有多种异源系统被用来进行哺乳动物CYP450的表达,每一种系统都各具优缺点.哺乳动物CYP450在大肠埃希菌上的表达是在实验室中的主要表达方式,但采用不同方式表达的蛋白量不一样,而且对蛋白酶的活性也有着一定的影响;同时,蛋白纯化手段的选择也会影响CYP450表达方式的应用.该文对哺乳动物CYP450在大肠埃希菌上的表达纯化现状和应用进行概述.
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蚊虫细胞色素P450基因系列研究
报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近5年来有关蚊虫细胞色素P450基因(CYP450)系列研究结果,包括:①通过简并引物PCR分别从致倦库蚊、白纹伊蚊及中华按蚊中获得3个、2个、2个CYP4家族成员基因片段;通过简并引物PCR及RT-PCR从白纹伊蚊中获得16个CYP6家族成员基因片段;②利用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得了白纹伊蚊CYP6家族3个新的全长cDNA序列及7个超过其全长一半以上的cDNA序列.GenBankaccessionnumber分别为AF283836-AF283838(全长cDNA序列)和AF284782-AF284783(非全长cDNA序列),被国际P450命名委员会正式命名为CYP6N3v1-v3(全长cDNA序列)和CYP 6N3v4、CYP6N4v1-v6,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中;③运用基因步移方法从白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP6N3上游3 076 bp调控序列;④对白纹伊蚊CYP 6N3、CYP6N4非翻译区序列功能分析显示:昆虫CYP450与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似,但具有多态性的特点;⑤对白纹伊蚊CYP6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示:蚊虫中CYP450转录起始存在着复杂性;⑥证实蚊虫中CYP6存在多样性,并分析讨论了此种多样性形成的可能机制;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P450 CYP6家族分子进化机制;⑧阐明了下一步研究的目标.
