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尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH的构建及鉴定
目的 构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛的fimH基因真核表达载体,为尿路致病性大肠埃希菌的核酸疫苗研制奠定基础.方法 通过PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌临床分离株的fimH全基因序列,克隆至pMDl9-T载体,PCR、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒,并进行PCR和酶切鉴定.结果 PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌fimH基因片段为910 bp;构建的pcDNA3.0-fimH重组质粒经BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切,产生1个与fimH基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-fimH重组质粒的大片段,表明fimH基因已成功插入pcDNA3.0质粒中.结论 成功构建尿路致病性大肠埃希菌fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH.
关键词： 尿路致病性大肠埃希菌 fimH 核酸疫苗 -
FimH重组蛋白的原核表达及纯化
目的:在大肠杆菌中构建并表达3种FimH重组蛋白,并对FimH重组蛋白的培养条件进行优化,制备高纯度FimH重组蛋白.方法:采用原核表达载体pET28a构建出能表达FimH的重组质粒,并分别对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等条件进行优化,以提高重组蛋白的产量和增大其可溶性,后以亲和层析分离纯化3种FimH重组蛋白.结果:成功构建出表达大肠杆菌(K12,BL21)和沙门氏菌(S.T.)FimH的原核表达载体pET28a-K12/BL21/S.T.,经酶切、测序和Western Blot鉴定,目的蛋白表达正确.在适当浓度的IPTG诱导,15℃震荡培养20 h,可使FimH的表达量达到大,分离纯化的蛋白在SDS-PAGE中显示为一条带.结论:本研究构建以3种FimH为表面呈现系统的表达载体,3种FimH基因和预测蛋白结构略有差异.本研究为后续研究3种蛋白 生物活性差异及其靶向M细胞的免疫佐剂活性提供物质基础.
