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环丙沙星对蚯蚓的急性和慢性毒性试验
目的 利用环丙沙星胁迫蚯蚓的毒性试验研究环丙沙星对土壤生物的毒性效应.方法 分别采用滤纸接触法和人工土壤法测得不同暴露浓度的盐酸环丙沙星(ciprofloxacin hydroehloride,CH)对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)的半数致死量(LD50)和体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)的活性.结果 滤纸接触法测得的24、48和96 h的LD50依次为2.20 ×10-1、1.60×10-1和1.12×10-1 mg/cm2.人工土壤法急性毒性试验中,蚯蚓未出现死亡,说明盐酸环丙沙星胁迫蚯蚓的LD50＞5 000 mg/kg.酶活性测定结果显示,1 000 mg/kg的浓度组暴露2d后的POD活性是对照组的2.48倍(P＜0.05),56 d 5 000 mg/kg组的SOD活性是对照组的1.83倍(P＜0.05),而1 000 mg/kg组活性受到抑制,是对照组的0.65倍(P＜0.05).结论 环丙沙星对蚯蚓存在一定毒性作用,短期(≤14 d)暴露POD活性较为敏感,长期(＞14 d)暴露SOD和CAT活性较为敏感,三者的活性可作为有效的生物标志对环丙沙星引起赤子爱胜蚓的毒性做出评价.
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勿把蚯蚓误认为人体寄生虫
蚯蚓是一类环节动物,在自然界中以陆生、水生或寄生而广泛存在,但有一种赤子爱胜蚓却鲜为人知.它颜色深红,个体较大,长约6～12 cm,常被人们误认为是自己体内排出的虫体而惶恐就医.
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蚓激酶新临床应用进展
蚓激酶是从露天红赤子爱胜蚓中提取的一种具有纤溶活力的丝氨酸蛋白酶.它可直接溶解纤维蛋白,并具有纤溶酶原激活剂的作用,病人应用后可促进纤溶,改善凝血及血液流变学指标.广泛用于心、脑血管疾病、突发性耳聋、视网膜血管疾病、血管外科疾病等多种疾病的治疗、康复和预防.现将临床应用和不良反应作一介绍.
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四溴双酚A和镉联合暴露对蚯蚓和斑马鱼毒性作用特征研究
目的 探讨四溴双酚A(TBBPA)、镉(Cd)联合暴露对不同生物体(赤子爱胜蚓、斑马鱼)的毒性作用特征.方法 将蚯蚓、斑马鱼置入设定的TBBPA、Cd单独、联合暴露剂量组,蚯蚓暴露于TBBPA浓度范围为0.1～10 mg/L,Cd为75～1 500mg/L,斑马鱼暴露于TBBPA浓度范围0.1～4.5 mg/L,Cd为4.64～30 mg/L,分别观察、计算暴露48、96 h蚯蚓、斑马鱼的死亡率、体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力,采用AI指数相加法、析因设计的方差分析法判断TBBPA、Cd对蚯蚓、斑马鱼的联合作用类型.结果 在本研究的实验剂量范围内,蚯蚓、斑马鱼的死亡率均随TBBPA、Cd单独、联合暴露浓度的升高而上升,而蚯蚓的SOD、CAT活力随染毒浓度的变化无规律,斑马鱼的SOD、CAT活力均随暴露浓度的升高而降低,存在着明显的剂量-效应关系;48、96 h时蚯蚓相加指数(AI)分别为0.15、0.13,斑马鱼AI分别为0.098、0.13.结论 TBBPA、Cd对蚯蚓死亡率表现为协同作用,SOD、CAT活力未有明显的作用趋势;对斑马鱼死亡率、SOD、CAT活力均呈现为协同作用.
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参环毛蚓中溶栓活性蛋白酶的纯化和检测
参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)为<中华人民共和国药典>2000年版一部中收载的地龙药材来源之一.地龙始载于<神农本草经>,具有通络、利尿、清热、定惊、平喘之功,临床常用于高热神昏、惊厥抽搐、关节痹痛、半身不遂、高血压等.日本学者从赤子爱胜蚓中提取出类似尿激酶的物质,用于治疗血栓性疾病[1].近年来,随着分离技术的飞速发展及其广泛应用,对不同品种蚯蚓溶栓活性蛋白酶进行了一系列的研究,但参环毛蚓(广地龙)作为药典品种及市场上流通广的地龙药材研究相对较少.本实验对其抗栓活性部位进行了考察,采用凝胶柱色谱法在溶栓活性部位中分离得到一种溶栓活性的蛋白酶.
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赤子爱胜蚓质量控制及提取工艺研究
目的:应用薄层色谱法对赤子爱胜蚓进行了鉴别,确定其重金属检查方法,并规定重金属限度,摸索炮制方法及条件,建立质量控制方法.方法:以溶栓试验为指标,进行溶栓成分的提取、干燥,绘制提取物的冷冻干燥曲线.结果:赤子爱胜蚓鲜活体匀浆后离心处理,收集上清液后,残渣再加水搅拌、离心处理1次,即可使提取率达93%以上.结论:该方法可大限度地保证溶栓成分的稳定提出.
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赤子爱胜蚓DNase活性测定方法
目的研究赤子爱胜蚓-地龙组织提取物DNase活性测定方法.方法应用单相酶扩散法和紫外吸收法分别对其酶解底物DNA测定.结果和结论两种方法同时应用可扩大其测定酶活力范围,且两方法的数据结果间存在稳定的函数关系,为赤子爱胜蚓DNase以及其他DNase的活力测定提供了可行的实验方法.
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参环毛蚓与赤子爱胜蚓的对比研究
目的:赤子爱胜蚓的抗检活性可靠,为评价参环毛蚓的溶栓的药用价值,进行了相关的对比研究.方法:通过纤维蛋白平板试验对比活性,通过电泳法对比酶谱.结果:2种蚯蚓活性相近,参环毛蚓及赤子爱胜蚓的许多酶谱的分子量都相近,分子量多在60000以下,主要集中在30000左右.结论:参环毛蚓与赤子爱胜蚓活性与酶谱相近,具有进一步开发价值.
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赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白的一级结构特征
背景：前期研究从赤子爱胜蚓组织中获得一组核酸酶样蛋白，对该组核酸酶样蛋白的一级结构进行研究，有利于揭示其结构的基本性质，为进一步结构与功能的研究奠定基础。
目的：对核酸酶样蛋白EWD1和EWD2进行一级结构的测定。
方法：采用Edman降解法测定EWD1和EWD2的N末端氨基酸序列，采用酸水解法测定其氨基酸组成， LC-MS/MS测定蛋白质内部分氨基酸的序列，MALDI-TOF-MS测定蛋白的含糖量和二硫键数目。
结果与结论：核酸酶样蛋白EWD1和EWD2的氨基酸组成中，天冬氨酸和天冬酰胺之和的含量高，都达到近10%，疏水氨基酸亮氨酸的含量也较高，半胱氨酸含量较少，氨基酸组成比较显示，该2种酶与其它核酸酶较相似。Edman降解法测定，EWD1蛋白大亚基的N末端6个氨基酸序列为：D、E、W、V、Y、P，EWD2蛋白的N末端9个氨基酸序列为：L、L、G、P、Y、K、P、K、C；串，联质谱的结果提示2种核酸酶为新蛋白；MALDI-TOF-MS法显示1号核酸酶中含有8个半胱氨酸，形成4对二硫键，2号核酸酶中有6个半胱氨酸，形成3对二硫键。EWD1，2均为糖蛋白，EWD1中的含糖量为17.3%，EWD2蛋白中的含糖量为15.6%。 -
地龙肽对小鼠NK、MΦ细胞活性的影响
地龙又称蚯蚓,是我国宝贵的中药材之一.临床上常用于治疗细菌、病毒感染性疾病、免疫性疾病和肿瘤[1,2].本实验所用的地龙肽(Lumbricus Peptide,LP)是从新鲜正蚓科爱胜属赤子爱胜蚓体内提取的小分子量多肽.很多文章已经报道了地龙提取物有细胞和体液免疫的作用[3,4],本实验室已证实LP可增强巨噬细胞和NK细胞分泌TNF、NO的水平,提高机体的免疫功能.在本实验中我们通过给小鼠口服不同剂量的LP,就其对巨噬细胞及NK细胞非特异性免疫功能的影响进行了研究,为地龙肽将来能应用于临床提供实验理论依据.
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蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶EWD3的生化性质
目的 研究赤子爱胜蚓组织中1种脱氧核糖核酸酶(EWD3)的主要生化性质.方法 采用Lowry法测定酶的蛋白含量,SDS-PAGE和MALDI-TOF方法测定相对分子质量,毛细管等点聚焦电泳法测定等电点,并测定EWD3酶的酸、碱稳定性、温度稳定性、激动剂和抑制剂对酶活性的影响及酶促反应米氏常数Km值.结果 EWD3酶的蛋白含量为2.1 mg/ml,相对分子质量为63 460,等电点为6.20,Km值为1.52 mg/ml,适pH值为4.4～5.2,不耐高温.Mg2+、Ca2+、Mn2+、10和20 mmnol/L EDTA对EWD3酶活性有抑制作用.这些参数与已发现的各种DNases相比有明显差异.结论 蚯蚓组织中已发现的脱氧核糖核酸酶EWD3具有特殊的酶学特征.
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赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白的纯化及其活性
目的 纯化赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白,并鉴定其活性.方法 将制备的赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白粗提液透析后,经Bio-CAD CM柱层析系统非连续梯度洗脱,收集洗脱峰,对有活性的梯度洗脱峰样品进行单向聚丙烯酰胺凝胶电泳(1D-PAGE)及切胶纯化,将切胶回收纯化的蛋白样品进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE),回收蛋白,进行活性和浓度检测.结果 透析后的蛋白粗提液经Bio-CAD CM柱层析分离,得到3个不同洗脱梯度的可降解DNA的活性峰,3个梯度蛋白的PAGE带型基本一致,经PAGE分离获得3个核酸酶样蛋白纯品EWD1、EWD2和EWD3,得率和纯化倍数分别为:27.9％,11.6;16.7％,11.2;16.7％,18.6.结论 成功纯化了赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白,并保持了其良好的生物活性.该纯化方法简单、快速、经济、实用,为该蛋白结构及功能的进一步研究奠定了基础.
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赤子爱胜蚓蚓激酶的异源表达及重组酶性质初步研究
利用基因工程技术从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida) cDNA中克隆得到一条全长为738 bp的蚓激酶编码基因Eflk(GenBank登录号KY452025),其编码245个氨基酸,与粉正蚓(Lumbricus rubellus) F-III-2的核苷酸和氨基酸序列同源性高分别为96.21％和97.14％.利用生物信息学方法预测分析蚓激酶EFLK蛋白分子主要由β折叠结构组成,理论等电点(pI)为4.97,其活性中心为Arg15-Phe19-Pro20-Glu66-Asn113”,位于loop结构所形成的隧道结构中.将该基因与pPIC9k载体相连接后电击导入毕赤酵母GS1l5中得到重组表达菌株GS 115-pPIC9K-Eflk,重组菌株经甲醇诱导发酵72 h,发酵液中蚓激酶活力达到224.8u/ml.纯化后重组酶蛋白的比活力为4 545.84 u/mg,相对分子质量为2.7×104.酶学性质研究结果表明该酶的适pH值为8.0,在pH 5.0～9.0范围内催化活力较高;在低于40℃条件下该酶的催化活性较稳定.
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一种新型蚯蚓纤溶酶组分的部分性质研究
目的获得一种高效的溶栓药物.方法从赤子爱胜蚓(Eisenia foelida)中共提取6种纤溶酶组分,分别命名为F1～F6.取F1用Lowry法测定蛋白质浓度,SDS-PAGE鉴定纯度及表观相对分子质量(Mr),纤维蛋白平板法测定其纤溶活性,测定其水解BAEE(Nα-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐)、血浆纤溶酶特异性底物Chromozym PL(苄氧羰酰甘氨酰脯氨酰精氨酰对硝基苯胺盐酸盐)及组织型纤溶酶原激活剂Chromozym t-PA(N-甲磺酰苯丙酰甘氨酰精氨酰对硝基苯胺盐酸盐)的活性,并进行N端氨基酸序列测定.结果F1纯度为100%,表观Mr为28 500,总纤溶活性为65.51×103mm2/mg,水解BAEE的米氏常数(Km)为2.808 7×10-2mol/L.对chromozym PL及chromozymt-PA的亲和力较低.F1的N端氨基酸序列为ⅡGGSNASPGEFPWQ,且对天然凝血块有较强的溶解作用.结论F1为纯度很高的单一组分,纤溶活性较高.
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蚯蚓纤溶酶的纯化及pH值、温度和胰蛋白酶对其纤溶活性的影响
目的纯化并鉴定蚯蚓纤溶酶,研究pH、温度和胰蛋白酶对其纤溶活性的影响.方法以赤子爱胜蚓为材料,采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose CL-6B离子交换色谱、Sephadex G-75凝胶过滤和制备电泳等分离技术纯化蚯蚓纤溶酶;利用纤维平板和聚丙烯酰胺凝胶电泳研究pH、温度和胰蛋白酶对蚯蚓纤溶酶纤溶活性的影响.结果分离得到纤溶酶4种单一组分:EFE-1、EFE-2、EFE-3、EFE-4;分子量分别为27 000、28 000、23 000、33 000;4种组分对温度的适应范围较广;pH值对其纤溶活性的影响不尽相同,但都在pH低于1.5时纤溶活性完全丧失;胰蛋白酶对纤溶酶4种组分均无降解作用,对其纤溶活性无影响.结论纤溶酶口服药制剂宜制成肠溶型.
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人工养殖赤子爱胜蚓中重金属及有害元素的测定
目的 建立人工养殖赤子爱胜蚓中铅、镉、砷、汞、铜含量测定的方法,并测定6批赤子爱胜蚓药材中铅、镉、砷、汞、铜的含量.方法 采用微波消解样品,用石墨炉原子吸收法测定铅、镉的含量;火焰原子吸收法测定铜的含量;原子荧光光谱法测定砷、汞含量.结果 铅的回收率为103.6％(RSD=6.4％),镉的回收率在92.0％(RSD=7.7％),铜的回收率在101.6％(RSD=8.1％),砷的回收率在94.4％(RSD=4.7％),汞的回收率在93.6％(RSD=5.4％).结论 本方法操作简便、快速,且准确度和精密度高,适合于赤子爱胜蚓药材中铅、镉、铜、汞和砷的含量测定.
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蚓激酶胶囊治疗脑梗死病人的临床观察
蚓激酶是从露天红赤子爱胜蚓中提取的一种丝氨酸蛋白酶,具有典型的胰凝乳蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的多肽链折叠形式,与纤维蛋白原有特异的亲和力,且具有纤溶活力.蚓激酶胶囊能明显降解纤维蛋白原,降低血小板聚集率及血液粘度.我们采用随机双盲、安慰剂对照(2:1)观察蚓激酶胶囊治疗脑梗死病人的临床疗效及安全性,尤其关注对纤维蛋白原等实验指标的影响,现报告如下.
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赤子爱胜蚓纤溶酶的理化性质研究
用硫酸铵分级沉淀和制备性电泳,从赤子爱胜蚓(Eisenia foelida)粗制品中纯化出5种组分(Ⅰ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ),在PAGE中均呈单一蛋白带.SPS-PAGE测得分子量分别为32000、26500、26000、24500和21500.等电点为3.80～4.25不等,大吸收峰均在276nm.5种组分的适pH在8.5左右,适温度为60±2℃.在pH6.0～10.0和60℃以下有较高的稳定性,组分Ⅰ在70℃、10min活性不变,对某些变性剂表现很强耐受性.组分Ⅰ的活性不能被贵州小慈菇蛋白酶抑制剂抑制.
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HPLC法同时测定赤子爱胜蚓药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、腺苷的含量
目的:建立同时测定赤子爱胜蚓药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、腺苷含量的方法.方法:采用高效液相色谱法.色谱柱为Venusil XBP C18,流动相为50%甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(梯度洗脱),流速为1.0 ml/min,检测波长为254 nm,柱温为30℃,进样量为10μl.结果:尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、腺苷检测进样量线性范围分别为0.05~1.60μg(r=0.9991)、0.05~1.60μg(r=0.9993)、0.002~0.010μg(r=0.9991)、0.0075~0.24μg(r=0.9999)、0.0250~0.80μg(r=0.9990);精密度、稳定性、重复性试验的RSD<3%;加样回收率分别为98.30%~100.76%(RSD=0.8%,n=9)、98.68%~100.96%(RSD=0.8%,n=9)、95.16%~97.67%(RSD=0.9%,n=9)、96.15%~99.57%(RSD=1.5%,n=9)、96.39%~101.93%(RSD=1.8%,n=9).结论:该方法操作简便、稳定、重复性好,可用于赤子爱胜蚓药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、腺苷含量的同时测定.
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蚯蚓体腔液抗病毒活性及其机制的研究
[目的]以赤子爱胜蚓为原料,研究其体腔液的抗病毒活性及可能伪机制,为新型抗病毒药物的开发提供思路.[方法]用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法测定蚯蚓体腔液蛋白酶活性和核酸酶活性;用鸡胚培养检测其抗流感病毒的活性,乙型肝炎病毒表面抗原及e抗原诊断试剂盒检测其对乙型肝炎病毒表面抗原及e抗原的破坏作用.[结果]蚯蚓体腔液具有蛋白酶活性、核酸酶活性每抗病毒活性;各种不同浓度的蚯蚓体腔液对流感病毒的增殖都有显著的抑制作用,且可以抑制乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原表达,呈浓度依赖关系.[结论]蚯蚓体腔液具有抗病毒活性,其可能机制是蛋白酶、核酸酶及各种活性成分单独和/或协同作用的结果.
