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两种原位DNA断链标记技术检测组织切片和培养细胞中的凋亡细胞
目的开发应用范围广,特异性、敏感性高的凋亡细胞检测技术.方法用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法(TUNEL)和Klenow大片段介导的原位缺口翻译法(ISNT)检测了甲基泼尼松龙处理的SD大鼠胸腺组织,正常鼠肠粘膜组织、肿瘤组织等标本的石蜡组织切片,和体外培养的肿瘤细胞药物处理后发生凋亡的细胞爬片,以及再生障碍性贫血(再障)病人的骨髓涂片.结果在大鼠胸腺组织中可见大量凋亡的T淋巴细胞,鼠肠粘膜组织粘膜上皮细胞以凋亡的方式更新脱落,肿瘤组织中可见散在的凋亡细胞.药物处理的肿瘤细胞和再障病人骨髓细胞中有较多的凋亡细胞.被染成棕色或棕褐色的细胞在形态学上符合凋亡细胞的形态学改变.结论此两种方法可用于检测组织切片和培养细胞中的凋亡细胞,可以检测早期的细胞凋亡、并可通过计算标记指数对凋亡细胞进行定量或半定量,是不失于研究体内组织细胞凋亡的首选方法之一.
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乙型肝炎相关性肝癌患者围手术期HBV DNA的变化及其影响因素
目的：探讨乙型肝炎相关性肝癌患者围手术期HBV DNA水平变化的影响因素，比较抗病毒治疗与未抗病毒治疗对患者术后肝功能恢复的影响。方法选择65例未达到抗病毒治疗标准的乙型肝炎相关性肝癌患者，定量检测其术前和术后第3天的HBV DNA载量及白细胞介素（IL）-6、IL-10、IL-27的水平。根据术后HBV DNA载量，将患者分成HBV DNA升高（激活）组和不变组。升高组给予抗病毒治疗。记录所有患者术前、术后肝功能指标。用SPSS 17.0进行统计学分析。结果入组患者HBV激活率为37%（24/65），术前HBV DNA＜1×104 IU/ml的患者，术后HBV激活率为75%（18/24）。Logistic回归分析显示肿瘤直径（P =0.006）及肝切缘无水酒精注射（P =0.004）是引起HBV再激活的独立危险因素。ELISA结果示术后IL-10升高与HBV再激活有关（P =0.001），IL-6升高及IL-27降低与HBV不变有关（P=0.000）。术后HBV DNA升高且行抗病毒治疗的患者，术后肝功能恢复情况与其他患者比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。结论肝癌切除术可能引起患者HBV再激活，围手术期内应监测HBV DNA载量的变化。肿瘤直径、术中行肝切缘无水酒精注射术是HBV再激活的独立危险因素。患者术后IL-10、IL-6水平的变化可能与HBV DNA的变化有关。术后HBV再激活近期不会加重肝功能损伤，术后抗病毒治疗对患者近期肝功能的恢复无明显促进作用。
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表达抗血管内皮细胞生长因子核酶和白细胞介素24腺病毒载体的构建及其对结肠癌HT-29细胞的毒性作用
肿瘤的发生是一个多基因改变过程,因此,在肿瘤基因治疗过程中,以单一基因为靶点的治疗很难取得显著的抗肿瘤效果.我们构建了同时带有双基因抗血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)发夹状核酶(Rz)和白细胞介素24(interleukin-24,IL-24)的腺病毒载体,并初步观察了其对结肠癌HT-29细胞的毒性作用.
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抽动障碍患儿A族溶血性链球菌抗体的测定
目的探讨A族溶血性链球菌感染在抽动障碍发病中的作用.方法采用抗DNA酶B微量法,测定46例抽动障碍患者和46名健康对照的抗DNA酶B抗体.结果抽动障碍患者抗DNA酶B的几何平均滴度(0.19 U/L)高于健康对照(0.12 U/L;t=2.17, P＜0.05);抗DNA酶B的阳性率(52%,24/46)也高于健康对照组(30%,14/46),差异有显著性(χ2=4.48,OR=2.49,P＜0.05).抽动障碍患者抗DNA酶B滴度与耶鲁抽动症整体严重度量表评分间呈正相关(r=0.35,P＜0.05).结论 A族溶血性链球菌感染可能与抽动障碍发病有关.
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局灶性脑缺血再灌注后半胱氨酸蛋白酶-3和其激活的DNA酶与神经元损伤的关系及半胱氨酸蛋白酶-3抑制剂的保护作用
目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)及由半胱氨酸蛋白酶激活的DNA酶(caspase-activated deoxyribonuclease,CAD)的表达变化与神经元损伤的关系,研究caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO对缺血神经元的保护作用.方法 实验设干预组和模型组,线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞1 h后再通模型,干预组于侧脑室给予Ac-DEVD-CHO,模型组给予二甲基亚砜(DMSO).应用HE、免疫组织化学、TUNEL染色及电镜观察大鼠大脑中动脉栓塞1 h后再灌注6、12、24、48、72 h时caspase-3和CAD蛋白的表达及神经元损伤程度的变化.结果 HE染色和电镜观察下,模型组和干预组差异不明显;TUNEL染色阳性细胞数除6 h外,两组间其余时间点相比差异具有统计学意义;模型组和干预组caspase-3蛋白表达24 h达高峰,分别为2.360±0.318与0.804±0.206(t'=10.039,P<0.01),12～48 h与模型组同期相比差异均有统计学意义;模型组和干预组CAD蛋白表达于48 h达高峰,分别为3.061±0.567与0.812±0.240(t'=8.960,P<0.01),12～72 h与模型组同期相比差异均有统计学意义.结论 caspase-3-CAD-DNA降解途径是鼠脑缺血再灌注神经元损伤的重要途径,caspase-3抑制剂具有一定程度的神经保护作用.
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蚯蚓脱氧核糖核酸酶纯化及酶学性质
目的:从蚯蚓组织中纯化得到一种脱氧核糖核酸酶(取名为蚯蚓脱氧核糖核酸酶,简称EDNase)并研究其酶学性质.方法:采用丙酮沉淀、离子交换层析、高效液相层析、SDS-PAGE电泳,毛细管等点聚焦电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等方法.结果:经证实这种纯化方案的纯化倍数是137,酶得率为45.6%.EDNase的相对分子质量约为63 000.Mg2+,Mn2+和ca2+对酶活性有较强的抑制作用,而Na+则轻微的提高酶的活性.在pH 4.4～5.2的范围内EDNase酶活性稳定,其适pH值为4.8.该酶的适温度为37℃,在40℃范围内酶具有较高的稳定性.EDNase的等电点为6.20.在以小牛胸腺DNA为底物的条件下,酶的Km为1.52 g/L,Vmax为4.89 mg/(mL·min).该酶可有效降解超螺旋质粒DNA,线状λ-噬菌体DNA和细菌染色体DNA,对RNA未见任何降解作用.结论:这种酶具有独特的酶学性质,不同于以往所知的脱氧核糖核酸酶.
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乙型肝炎病毒共价闭合环状核糖核酸检测的临床意义及方法研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状核糖核酸(cccDNA)是HBV在肝细胞内复制的起始模板,是HBV持续感染的关键因素,能直接反映机体内HBV感染状态及复制情况.HBV cccDNA检测可作为评价抗乙肝病毒药物的有效指标.HBV cccDNA是判断HBV是否感染肝外组织的客观指标之一.血清中发现HBV cccDNA为肝细胞受损的一个重要的早期标志.HBV cccDNA定性检测主要有套式聚合酶链式反应(PCR)、选择性PCR、Southern印迹杂交法等;其定量检测的方法包括实时荧光定量PCR检测法、竞争PCR检测法、入侵者检测法等.现阶段临床检测方法普遍存在一定的不足和缺陷,尚未形成统一标准的HBV cccDNA敏感度、特异度检测体系;需进一步展开深入的研究与探讨,寻求理想检测手段,为临床诊疗提供更加可靠的参考依据.血清HBV RNA的水平可能是反映患者肝细胞内cccDNA存在和转录的好指标.
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反义核酸类药物的药理学研究进展
反义核酸技术是20世纪80年代出现的一种以应用反义核酸类药物来抑制特定基因表达为目的的基因治疗技术.反义核酸类药物包括反义寡核苷酸和核酶.前者是人工设计合成的与特定基因互补的寡核苷酸,它能通过W-C配对与特定基因结合来抑制其表达.核酶是具有RNA裂解活性的RNA.
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自切割核酶介导的转基因淋巴细胞有效抑制猴免疫缺陷病毒的感染和致病
目的 获得抗猕猴免疫缺陷病毒(SIV)转基因的淋巴细胞。方法 将锤头型核酶切割的一段靶序列连接在核酶下游构成自切割核酶，人工合成的自切割核酶基因扩增并克隆在pBluescript SK的XhoI-SalI位点，通过连续4次克隆获得10拷贝核酶基因的载体。转染前测定自切割核酶的体外活性并将之转移至哺乳动物表达载体上，脂质体法转染含核酶基因的表达载体，转染细胞在含400 mg/L G418 的培养介质中筛选。转基因细胞对猴免疫缺陷病毒的抗性通过免疫荧光测定来估测。结果 37℃孵育15 min后85％的十体核酶自切割成单体核酶。在初始25 min的反式切割反应中尽管10体核酶摩尔数不足单体核酶十分之一，但十体核酶平均超过单体核酶13.31％的切割产物。Northern 点杂交证明单体核酶基因和十体核酶基因已经转入细胞并在细胞中获得表达。SIV攻毒试验表明，SIV接种6 d后转染单体核酶基因的细胞生长正常，不出现融合细胞，绝大多数转染十体基因的细胞生长良好，只发现极少数的融合细胞；转染单体核酶基因细胞的SIV抗原阳性细胞抑制率达到100％，转染十体核酶基因细胞的SIV抗原阳性细胞抑制率为91.2%, 转空表达载体细胞为48％。结论 转自切割核酶基因的细胞对SIV的感染和致病均表现较强的抗性，但单体核酶比10体核酶对SIV的感染和致病表现出更好的抑制效果。
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我国部分地区学龄儿童抗DNA酶B正常值水平探讨
目的探讨我国部分地区学龄儿童抗DNA酶B抗体正常值水平.方法从1994年9月至1995年8月,对我国不同地理位置4个省的学龄儿童[年龄8～13岁,平均(11.0±2.3)岁],包括湖北103名、广东589名、四川283名、吉林215名,共1190名(男618名,女572名),每3个月抽血1次,用微量法统一测定血清抗DNA酶B抗体水平.结果①抗DNA酶B的几何均值(GMT)水平:各地区间均差异有显著性(P＜0.01),以湖北高(198 U/ml),其次是广东(140 U/ml)、四川(122 U/ml),吉林低(85 U/ml).GMT水平较高的季节多在冬、春和秋季,夏季普遍较低.男女间差异无显著性(P＞0.05).②抗DNA酶B正常值上限:我国不同地区学龄儿童正常值上限为200～320 U/ml,4省合计为240 U/ml.其中湖北高(320 U/ml),广东次之(240 U/ml),吉林和四川相同(200U/ml).结论正常值上限(240 U/ml)基本反映了我国不同地区学龄儿童抗DNA酶B正常水平,结果可信,可作正常值供临床和科研工作者参考.
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研究蚯蚓DNase的干琼脂糖薄膜覆盖法
目的 研究蚯蚓脱氧核糖核酸酶(DNase)的测定方法.方法 应用干琼脂糖薄膜覆盖法(DAFO)检测蚯蚓DNase.结果 DAFO用于蚯蚓DNase的种类、数量的确定,新DNase类的筛选以及DNase活性的测定.结论 DAFO是研究脱氧核糖核酸酶的一种重要方法.为蚯蚓DNase及其他DNase的测定提供了可行的实验方法.
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一种新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶相对分子质量的测定
目的 测定从蚯蚓组织中提取纯化的一种新型脱氧核糖核酸酶的相对分子质量.方法 采用凝胶过滤层析法、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法三种方法测定一种新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶(EWDi)的相对分子质量.结果 凝胶过滤层析法、SDS-PAGE法和质谱法测定其相对分子质量分别为126 440、136 320和157 190.结论 EWD1由两个亚基组成,其相对分子质量终确定为157 190.
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赤子爱胜蚓DNase活性测定方法
目的研究赤子爱胜蚓-地龙组织提取物DNase活性测定方法.方法应用单相酶扩散法和紫外吸收法分别对其酶解底物DNA测定.结果和结论两种方法同时应用可扩大其测定酶活力范围,且两方法的数据结果间存在稳定的函数关系,为赤子爱胜蚓DNase以及其他DNase的活力测定提供了可行的实验方法.
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脱氧核酶在转基因肝癌细胞中对HCV 5'-非编码区的抑制活性
目的观察特异性脱氧核酶(DRz)在丙型肝炎病毒(HCV)5'-非编码区(5'-NCR)转基因肝癌细胞株中对靶RNA的抑制活性.方法采用5'-GGCTAGCTACAACGA-3'基序为活性中心,分析HCV 5'-NCR中符合5'…R↓Y…3'(R=A/G,Y=U/C)特征的位点及5'-NCR的二级结构以确定靶位,设计并合成HCV靶向性脱氧核酶DRz-232、DRz-127、DRz-84、DRz1以及对应的两端被硫代修饰的DRz(TDRz)和活性中心区人工突变的硫代DRz(MDRz).用脂质体转染法将导入HCV 5'-NCR及部分C区(5'-NCR-C)的转基因肝癌细胞株HepG2.9706中,作用一定时间后,用化学发光法检测荧光素酶活性的变化,计算抑制率.选择抑制率较高者进行时效关系的观察和不同浓度抑制效果的比较.结果各DRz和对应TDRz的活性无明显差别.DRz-127/TDRz-127和DRz1/TDRz1的抑制活性相对较高,终浓度为0.5μmol/L作用24 h抑制率分别达53.2%/50.6%和44.7%/43.3%.各DRz/TDRz的抑制率均高于对应的MDRz,其中DRz-127/TDRz-127与MDRz-127(41.2%)相比抑制率有显著性差异,P＜0.05.在0.25～0.75 μmol/L范围,抑制率随药物浓度的升高而增高.在所观察的时间点中,加药后24 h抑制率高,3 d后抑制率显著下降;DRz抑制率的下降快于TDRz.结论靶位合适的HCV特异性脱氧核酶在转基因肝癌细胞中对靶RNA可能既存在反义抑制作用,又存在剪切活性,可能是一种有希望的抗病毒基因治疗手段.经适当硫代修饰的TDRz在细胞内可能更稳定.
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一种蚯蚓脱氧核糖核酸酶分离纯化和性质研究
蚯蚓组织的NaAc抽提液经过热变性、酸变性和丙酮分段沉淀,再经过DEAE-Sepharose和CM-Sepharose层析纯化,从中分离纯化得到一种脱氧核糖核酸酶(EWD2),经SDS-PAGE电泳、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)、毛细管等点聚焦电泳法测定.此DNase的相对分子质量测定为69 100,明显大于已发现的DNase Ⅰ和DNaseⅡ.该酶的等电点为6.05,温度稳定性、pH稳定性、激动剂和抑制剂等各项参数,与已发现的各种DNase相比较有明显差别.结果提示,蚯蚓组织中发现的这种脱氧核糖核酸酶具有特殊的酶学性质,可能是一种新型脱氧核糖核酸酶,其作用机理和分类还有待于进一步的研究.
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多发性抽动症患儿血清抗DNA酶B抗体、抗链球菌溶血素O和C反应蛋白的测定及其临床意义
目的 探讨A族溶血链球菌(GAS)感染和多发性抽动症(TS)的关系.方法 采用抗DNA酶B微量法及免疫比浊法分别测定39例TS患儿和40例非感染性疾病患儿抗DNA酶B抗体、抗链球菌溶血素O(ASO)和C反应蛋白(CRP)以确定链球菌感染.结果 TS患儿抗DNA酶B抗体的阳性率(51%,22/39)高于非感染性疾病对照组(30%,11/40)(P<0.05);ASO阳性率(41%,16/39)高于对照组(20%,8/40)(P<0.05);CRP的阳性率(31%,12/39)也高于对照组(3%,1/40)(P<0.01).结论 GAS感染可能和TS有关.
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替诺福韦与恩替卡韦治疗乙型肝炎E抗原阳性慢性乙型肝炎的效果比较
目的 比较替诺福韦(TDF)与恩替卡韦(ETV)治疗乙型肝炎E抗原( HBeAg)阳性慢性乙型肝炎(CHB)的临床效果及安全性.方法 选取天台县人民医院2014年6月至2016年6月收治的HBeAg阳性初治CHB患者104 例为观察对象,采用随机数字表法分为 TDF 组和 ETV 组各52 例. TDF 组给予 TDF 300 mg/d治疗,ETV组给予ETV 0. 5 mg/d治疗,均连续治疗12 个月.比较两组治疗前后血清HBV DNA、HBeAg、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平变化及临床疗效、不良反应发生情况.结果 治疗前,两组血清HBV DNA、HBeAg、ALT水平差异均无统计学意义(t =0. 12、1. 51、1. 62,均 P ＞0. 05).治疗后,两组血清 HBV DNA、HBeAg、ALT水平均下降,且TDF组血清HBV DNA水平下降幅度大于ETV组,差异有统计学意义( t=3. 54,P＜0. 05),但两组血清HBeAg、ALT水平差异均无统计学意义(t=0. 04、0. 79,均P＞0. 05). TDF组总有效率为92.31%(48/52),ETV组总有效率为76.92%(40/52),TDF组总有效率明显高于 ETV 组(χ2=4. 73,P＜0. 05).治疗期间TDF组不良反应总发生率为7. 69% (4/52),低于ETV组的11. 54% (6/52),但差异无统计学意义(χ2=0. 44,P＞0. 05).结论 与ETV相比,TDF治疗HBeAg阳性初治CHB的疗效更佳,可能与其显著抑制HBV DNA复制有关.
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锤头状核酶抑制Raji细胞表面主要组织相容性复合物Ⅱ类抗原的表达
目的探讨抗主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子转录激活因子的锤头状核酶对Raji细胞表面经典MHCⅡ类抗原表达的抑制作用.方法设计并克隆针对MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)第134、218、464位点的3个核酶片段(Rz134、Rz218、Rz464)及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pGEM-T载体,进行细胞外切割活性筛选.将切割作用明显的Rz464亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP,成为pIRES2-EGFP-Rz464(pRz464),将pRz464稳定转染Raji细胞株,流式细胞术检测Raji细胞表面MHCⅡ类抗原(HLA-DR、DP、DQ)的表达,并用逆转录聚合酶链反应分析Raji细胞CⅡTA mRNA的表达.结果转染pRz464的Raji细胞表面HLA-DR、DP、DQ抗原表达抑制率分别为95.93%、94.14%及98.32%,同时其CⅡTA mRNA的表达显著下调(P＜0.05).结论Rz464可抑制Raji细胞表面MHCⅡ类抗原的表达.
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尿嘧啶DNA糖苷酶防止PCR产物污染及其对核酸杂交的影响
目的采用PCR微板核酸杂交ELISA技术分析尿嘧啶DNA糖苷酶(UNG/UDG)防止PCR产物污染及其对PCR扩增效率的影响,探讨在不同A/T含量的微生物中含尿嘧啶的PCR产物对核酸杂交的影响.方法以3组dUTP含量不同的PCR产物作模板,抗污染组用UNG处理,直接进行再次扩增.用微板核酸杂交ELISA检测第二次PCR扩增的结果. 结果抗污染组中以含dUTP的PCR产物作模板,结果为阴性;而以不含dUTP的PCR产物作模板,结果为阳性.非抗污染组全部为阳性.对3组PCR产物再进行核酸杂交无明显差别,且在一定温度内,3组具有同样的稳定性. 结论 UNG能有效降解含dUTP的PCR产物,使之不能作为模板再次扩增,可以有效地防止PCR产物的污染.含有尿嘧啶的PCR产物对寡核苷酸探针的杂交无影响.
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宫颈癌组织中端粒酶活性表达与HPV感染的研究
目的:研究端粒酶活性在子宫颈癌组织发生发展中的作用及端粒酶活性检测在筛查子宫颈癌中的临床应用价值.方法:采用PCR-TRAP方法检测15例子宫颈癌组织标本和8例正常的子宫颈组织的端粒酶活性;采用PCR检测15例宫颈癌组织和8例正常的子宫颈组织HPV感染.结果:8份正常的子宫颈组织中未检出端粒酶活性,HPV阴性,15例宫颈癌组织中有13例端粒酶检测阳性,阳性率86.7%;13例中有12例是HPV阳性,阳性率是80%.结论:端粒酶活性表达在子宫颈癌的发生发展中起重要的作用,在宫颈癌中端粒酶活性与HPV感染密切相关.
