首页 > 文献资料
-
山西省从粪便中分离到产霍乱毒素的拟态弧菌
目的 从山西省霍乱样粪便中分离到拟态弧菌,并检测其是否携带霍乱毒素基因.方法 采集患者粪便、患者家用自来水、金鱼和鱼缸水标本,按照WS 289-2008和<霍乱防治手册>(第5版)方法,对标本进行增菌和选择性培养基的分离培养,疑似菌落以霍乱弧菌血清凝集试验检测,并用AP120E系统鉴定菌种.同时,疑似菌落用PCR检测01、0139群特异性和是否携带霍乱毒素基因.结果 粪便标本经增菌后接种选择性培养基,在庆大琼脂和碱性琼脂上均有霍乱弧菌疑似菌落,但在TCBS琼脂上为绿色、透明、中等大小、光滑、湿润的菌落;血平板上可见灰白色、湿润菌落,有透明溶血环;染色镜检湿片暗视野下未见流星状运动细菌.氧化酶和粘丝实验阳性,霍乱弧菌01、0139群血清凝集试验阴性.菌株经API20E鉴定为拟态弧菌(93.5%可能性).环境标本中未分离和检测到拟态弧菌.PCR检测该拟态弧菌中携带霍乱毒素基因,而01、0139群特异性为阴性.结论 从急性霍乱样腹泻粪便中分离到1株拟态弧菌,对于临床类似霍乱样症状的病例标本,当病原的霍乱弧菌血清凝集为阴性时,应进一步做霍乱毒素的检测.
-
霍乱毒素检测方法的研究
霍乱毒素是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,是霍乱弧菌的主要致病因子.本文介绍了霍乱毒素和霍乱弧菌产毒株检测技术的研究进展.
-
含扩增内对照的霍乱毒素基因ctx和不耐热肠毒素基因elt三重real-time PCR检测体系的建立
目的：建立一个含扩增内对照（IAC）的三重TaqMan real-time PCR体系，以检测霍乱毒素基因ctxA和肠产毒性大肠埃希菌的不耐热肠毒素基因elt。方法针对ctxA、elt和IAC设计引物和探针，进行灵敏性和特异性分析，评价三重反应之间的互相影响。结果该检测体系灵敏度为ctxA每个反应94拷贝，elt每个反应79拷贝，扩增效率分别为94.7%与98.1%。ctxA与elt拷贝数比例为1∶1～1∶10时，二者均能良好扩增；elt或ctxA的量是IAC的100倍以上时，IAC扩增受到抑制。结论该检测体系具有良好的灵敏性和特异性，可以用于腹泻粪便中感染病原菌的检测，其中内对照检测可以提示粪便样本中是否存在PCR抑制因子。
关键词： 霍乱毒素 不耐热肠毒素 实时荧光定量聚合酶链式反应 -
2001至2005年广州地区霍乱弧菌主要致病相关基因特征分析
目的应用多重聚合酶链反应(PCR)检测方法和测序研究近5年广州地区分离的霍乱弧菌的4种致病相关基因的携带情况及霍乱肠毒素基因ctxA的变异情况.方法针对霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)、小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)、毒素共调菌毛亚单位A基因(tcpA)设计引物,将多重PCR方法应用于广州地区分离的276株霍乱弧菌的致病相关基因的检测.对ctxA基因的PCR扩增产物进行核苷酸序列测定,探讨ctxA扩增产物的同源性.结果近5年广州地区分离的276株霍乱弧菌中,人源株中93.9%为致病相关基因A型(ctxA+tcpA+ace+zot+型)菌,其余6.1%为致病相关基因C型(ctxA-tcpA-ace-zot-型)菌,临床分离的致病相关基因A型菌分离自轻、中、重型病例和带菌者,其中有68.5%分离自轻型病例,21.9%分离自带菌者,临床分离的致病相关基因C型菌中有63.6%分离自轻型病例,36.4%分离自带菌者,C型菌引起带菌者的比例高于A型菌;78株环境分离株中9.0%为致病相关基因A型菌,35.9%为致病相关基因B型(ctxA-tcpA-ace+zot+型)菌,55.1%为致病相关基因C型菌.霍乱肠毒素基因ctxA变异较小.结论多重PCR方法揭示了广州地区霍乱弧菌致病相关基因模式的多态性,为深入研究人源和环境来源霍乱菌株致病相关基因的演化提供了有效手段,并对本地区霍乱的预防、控制和预警具有重要的指导意义.
-
酶联免疫吸附法测定三种CTB与其受体GM1的亲和性
霍乱毒素(cholera toxin,CT)是霍乱弧菌产生的相对分子质量为84 kD的肠毒素,由1个A亚单位(CTA)和5个B亚单位(CTB)形成的五聚体共价连接而成.CTA(大约28 kD)为毒性亚单位,CTB(大约12 kD)为无毒的受体结合亚单位,可以和所有有核细胞膜上的单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)结合.CTA则通过CTB与GM1的结合作用得以进入细胞发挥其毒性级联反应[1,2].目前,CTB已作为载体蛋白广泛用于基础研究.本文采用ELISA法测定了两种国产CTB与其受体GM1之间的亲和性,并与国际标准品CTB进行了比较.
-
霍乱毒素或联合外周神经对再生视网膜节细胞c-Jun表达的研究
目的:观察成年金黄地鼠视神经近端微挤压断(MC)后,再生视网膜节细胞(RGCs)c-Jun的表达与再生的关系.方法:实验动物随机分为CTx组、SN+CTx组,每组5只.近端微挤压断视神经后,玻璃体内注射霍乱毒素(CTx)或联合植入小段坐骨神经分支(SN).术后4W,用荧光金(FG)逆行标记和c-Jun免疫荧光组织化学双标法观察再生的RGCs和c-Jun的表达.结果:再生RGCs胞核内有c-Jun蛋白表达,CTx组表达c-Jun的再生RGCs为(317±61)个,约占其再生总数的89.9%;SN+CTx组c-Jun阳性再生的RGCs为(418±102)个,占再生总数的96.8%,两组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论:c-Jun表达可能与RGCs的再生有密切关系,霍乱毒素或联合外周神经可显著提高再生RGCs的c-Jun表达.
-
霍乱毒素对受损视网膜环磷酸腺苷和节细胞存活及凋亡的影响
目的研究霍乱毒素(CTx)对视网膜cAMP水平及视网膜节细胞存活及凋亡的影响. 方法视神经远端(颅内)切断,玻璃体内注射CTx,采用荧光逆行示踪技术及原位末端标记(TUNEL)技术显示存活的视网膜节细胞及节细胞层凋亡的细胞,Brown放射免疫法测定各时间点视网膜cAMP的水平. 结果远端切断视神经后各时间点cAMP水平均低于玻璃体内注射霍乱毒素组.视神经远端切断后视网膜节细胞平均密度明显下降,玻璃体内注射霍乱毒素后,节细胞平均密度明显提高,细胞凋亡数也明显少于单纯视神经切断组. 结论表明霍乱毒素可提高成年金黄地鼠视网膜cAMP水平并具有促受损视网膜节细胞存活及抗凋亡作用.
-
霍乱毒素对远端视神经损伤后视网膜节细胞再生的影响
目的探讨霍乱毒素(CTx)对成年金黄地鼠远端视神经受损后视网膜节细胞(RGCs)再生的作用.方法远端切断视神经并对接一段自体坐骨神经(AG),玻璃体内注射CTx及/或植入小段坐骨神经分支(SN).动物随机分为对照组Ⅰ(AG组)与对照组Ⅱ(溶剂组);AG+SN组;AG+CTx组;AG+SN+CTx组和量效关系组,前五组分别存活4周～6周,用粒蓝逆行标记再生的RGCs,荧光显微镜下观察. 结果 AG+CTx组各时间点再生的视网膜节细胞比对照组Ⅰ与对照组Ⅱ明显增加,具统计学意义(P＜0.05);AG+SN组得出相似结果.AG+SN+CTx组与其它几组相比在各时间点上均存在极显著性差异(P＜0.01). 结论霍乱毒素可明显提高远端视神经受损后视网膜节细胞的再生.
-
弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的Peyer's patches持续性细胞免疫应答
目的 以可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)和霍乱毒素 (cholera toxin,CT)佐剂制备的弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠,观察肠粘膜诱导部位Peyer's patches(PP)的细胞免疫应答及持续时间,探讨其免疫机制.方法 BALB/c小鼠96只,随机分为实验组和对照组,实验组以STAg(20 μg/只)为抗原,CT(1 μg/只)为佐剂滴鼻免疫,对照组PBS滴鼻.滴鼻2次(间隔2周)后,每组6只小鼠分别于第1、2、3、4、6、8、10、12周处死.计数PP个数,制备PP淋巴细胞悬液,计数并涂片;免疫细胞化学法检测CD4+、CD8+T细胞亚群.结果 实验期间两组小鼠PP数目均无明显变化;实验组免疫后PP淋巴细胞数量明显增生,第2周达高峰,第1、2、3周显著高于对照组(P＜0.05),其中以CD4+T细胞增生为主,第1周～第8周高于对照组(P＜0.01),CD8+T细胞第1周～第4周显著增高(P＜0.01),CD4+/CD8+比值无显著变化(P＞0.05).结论 弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠可有效诱导肠PP部位持续性的免疫应答,从而激活肠粘膜效应部位淋巴细胞的抗弓形虫感染作用.
-
STAg联合CpG ODN和CT鼻内免疫小鼠诱导的特异性抗体应答和脾淋巴细胞的特异性增殖反应
目的 观察可溶性速殖子抗原(STAg)联合CpG寡核苷酸(CpG ODN)和/或霍乱毒素(CT)鼻内免疫BALB/c小鼠后血清IgG、肠冲洗液IgA抗体水平及脾淋巴细胞体外特异性增殖反应,探讨CpG ODN和CT的佐剂效应. 方法 6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为5组,分别用20 μl PBS(PBS组)、20 μg STAg(抗原组)、20 μg STAg +10 μg CpG ODN(CpG佐剂组)、20 μg STAg + 1 μg CT(CT佐剂组)、20 μg STAg + 1 μg CT +10 μg CpG ODN(联合佐剂组)滴鼻,间隔2周,免疫2次.末次免疫后第20 d颈椎脱臼处死小鼠,收集血清和肠冲洗液,ELISA法检测血清弓形虫特异性IgG和肠冲洗液IgA.分离脾淋巴细胞,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测致敏脾淋巴细胞体外增殖活性. 结果 ELISA法测定PBS组、抗原组、CpG佐剂组、CT佐剂组及联合佐剂组小鼠血清IgG A值分别为0.025 6±0.012 1、0.054 2±0.024 4、0.109 4±0.007 5、0.110 1±0.009 1和0.124 6±0.013 7,肠冲洗液IgA A值分别为0.141 8±0.030 2、0.415 2±0.080 7、0.526 9±0.075 4、0.846 5±0.115 5和1.128 9±0.100 3,脾淋巴细胞刺激指数SI分别为1.159 0±0.275 5、1.364 0±0.349 8、1.582 0±0.375 3、1.928 0±0.278 9和2.371 0±0.646 9,差异均有统计学意义(P＜0.01);联合佐剂组肠冲洗液IgA水平和脾淋巴细胞的SI值与CpG佐剂组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 STAg联合CpG ODN和/或CT鼻内免疫小鼠可有效诱导机体免疫反应,两种佐剂联合免疫的效果优于单一抗原或抗原联合单一佐剂.
-
霍乱毒素联合弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的GALT和NALT黏膜免疫应答
目的 观察霍乱毒素(CT)联合弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)鼻内免疫小鼠诱导的肠相关淋巴组织(GALT)和鼻相关淋巴组织(NALT)黏膜部位的免疫应答.方法 将48只5～6周龄BABL/c小鼠随机均分为3组,分别用PBS、ESA和CT+ESA滴鼻免疫小鼠2次,间隔2周.末次免疫后14 d,处死小鼠,ELISA测定小鼠粪便和鼻咽冲洗液sIgA抗体水平;计数派伊尔淋巴集结(PP)、肠上皮淋巴细胞(IEL)、NALT和鼻通道(NC)淋巴细胞数,免疫细胞化学法检测CD4+、CD8+T细胞亚群水平.结果 免疫后14 d,CT+ESA组小鼠鼻咽冲洗液和粪便sIgA水平显著高于ESA组和PBS组(P＜0.01);CT+ESA和ESA组小鼠GALT部位的PP淋巴细胞显著增生,主要以CD4+T细胞为主;而IEL以CD8+T细胞增生为主,CD4+/CD8+比值降低(P＜0.05).CT+ESA NALT内淋巴细胞明显增生.CT+ESA组NC淋巴细胞显著升高(P＜0.01),以CD4+T细胞增生为主.结论 CT佐剂联合ESA滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱导GALT和NALT黏膜部位免疫应答.
-
霍乱毒素作为黏膜佐剂的研究进展
霍乱毒素(cholera toxin,CT)是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,既是强黏膜免疫原,又具有很强的黏膜佐剂活性,是当今研究多且深入的黏膜免疫佐剂之一.然而,由于CT其毒性,限制了在人体的使用.很多研究致力于使CT的佐剂性与毒性分离,CT亚基的佐剂性的研究就是方向之一.困扰黏膜疫苗的一个重要问题是很多抗原的黏膜免疫原性较弱,不能刺激有效的免疫反应,这也与黏膜免疫耐受有关,以CT为佐剂能消除机体对这些共免疫原的耐受.
-
产毒型O1群霍乱弧菌特异性基因序列实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立
目的 建立针对O1 群霍乱弧菌的高敏感、高特异的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系.方法 根据O1 群霍乱弧菌主基因组O 抗原编码基因rfb-O1 和霍乱肠毒素的A 亚基编码基因ctxA 的特异性序列设计引物及TaqMan 探针,利用便携式Smartcycler II实时荧光PCR 检测平台探讨该检测体系的敏感性,用19种其他肠道致病菌及院内感染常见致病菌评价该检测体系的特异性.结果 实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应快速检测体系对O1 群霍乱弧菌的检测敏感度为1.0 × 102 拷贝每反应体系;对O1 群霍乱弧菌基因组DNA 的检测敏感度为1.0 × 10-1 pg 每反应体系;该检测体系在检测19 种其他肠道致病菌或院内感染中的常见致病菌时不存在非特异性扩增;整个反应在2 h 内完成.结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan 聚合酶链式反应检测体系可作为产毒型O1 群霍乱弧菌特异、敏感、快速的检测手段,也可同时检测O1 群霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力.
-
产毒型O1群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR的临床应用前研究
目的 探讨产毒型O1 群霍乱弧菌实时荧光双重TaqManPCR 法对临床模拟标本检测的意义,为该法的临床应用提供可靠的技术依据.方法 将O1 群霍乱弧菌灭活菌株悬液[1.0 × 1011 CFU(菌落形成单位)/ml]连续10 倍稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成5.0 × 101～5.0 × 109 CFU/g 梯度浓度的模拟带菌者粪便标本并提取DNA,用以评价产毒型O1 群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR 法对临床模拟标本检测的灵敏度、特异性和稳定性.结果 实时荧光双重TaqMan PCR 法对O1 群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测灵敏度为1.0 × 103 CFU(5.0 × 104 CFU/g)每反应体系,其检测线性范围为1.0 ×103～1.0 × 108 CFU 每反应体系;在稳定性评价中,对含菌量1.0 × 103～1.0 × 108 CFU 每反应体系模拟带菌者粪便标本DNA 进行3 次重复检测的结果 显示,ctxA 基因扩增反应Ct 值的变异系数为0.54%～1.36%,rfb-O1 基因扩增反应Ct 值的变异系数为1.65%～3.75%;在特异性评价中,3 名健康成人新鲜粪便标本的阴性对照均未见特异性扩增曲线.结论产毒型O1 群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR法可用于O1 群霍乱弧菌临床粪便标本的检测.
-
CpG寡核苷酸链作为新型佐剂的研究进展
1924年Ramon提出免疫佐剂的概念,80多年来,虽然进行了深入的研究,人用疫苗佐剂主要还是铝胶佐剂.直到近几年才上市了几种新型的疫苗佐剂,如MF59(高压条件下将鲨烯与Tween 80 和Span 85混合后进行微流化形成的均一小滴状乳液,应用于美国Chiron公司开发的流感亚单位疫苗),重组霍乱毒素B亚单位(rCTB,应用于瑞典SBL Vaccin AB公司研发的霍乱疫苗Dukoral),AS04(一种含有单磷脂A和皂角苷的油包水乳剂,应用于英国GlaxoSmithKline公司的乙型肝炎疫苗Fendrix)等,但应用范围较小.
-
霍乱弧菌的一种新的不含毒素基因 CTXФ基因组的复制功能研究
引起霍乱流行的霍乱弧菌菌株在遗传方面的一个重要特点是都带有霍乱毒素(CT)的基因ctxAB.对O139群菌株的分析中,发现一种新的不含ctxAB的CTXФ基因组,其中的rstR基因和ig-2区与已发现的CTXФ基因组的相应序列无明显同源性,其他的基因很保守,也不含ctxAB基因,命名为nct-CTXO139Ф.
-
一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ
目的探讨介导霍乱弧菌毒素基因水平转移的一种独特的遗传结构. 方法从O139群霍乱弧菌菌株FJ97129上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ,并进行电镜观察.从丝状噬菌体颗粒CTAKΦ中纯化出DNA,并进行链型分析.对pCTAK进行酶谱分析.用ctxAB、zot引物对pCTAK进行PCR扩增检测,用RS1探针对pCTAK进行Southern blot检测;用pCTAK转化DH5α和IEM101得到DX29和4329,将pCTAK克隆于pUC18载体并转入DH5α得到UD29,用GM1-ELISA检测DX29、4329、UD29的CT表达.对pCTAK的ctxAB、zot基因片段进行测序,并用DNASTAR软件和BLAST算法,在国际互联网上对测序结果进行序列分析. 结果发现和分离了一种编码霍乱毒素的质粒pCTAK,它以稳定的高拷贝数存在于1株天然的O139霍乱弧菌FJ97129中;酶谱分析发现其明显不同于CTX元件酶谱,在CTX元件中相当保守的酶切位点:BglⅡ、EcoRⅤ、PstⅠ、EcoRⅠ,在pCTAK中没有切点. ctxAB、zot引物对pCTAK的PCR扩增检测呈阳性,RS1探针杂交呈阳性;pCTAK的ctxAB、zot基因序列与已报道的序列有很高的同源性.pCTAK能直接或经载体转化DH5α和IEM101并表达CT.从FJ97129培养上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ,电镜观察并计算其直径大小为7nm左右.其全基因组大小为8.5kb,为单链DNA. 结论发现了一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ.
-
与霍乱毒素A1亚基突变体相互作用蛋白的筛选
目的寻找新的与霍乱毒素A1亚基(CTA1)突变体(S63F)相互作用的蛋白,来探讨CT佐剂活性的分子机理. 方法应用酵母双杂交技术,以CTA1(S63F)为诱饵蛋白筛选人脾细胞cDNA文库,并通过共转染、免疫共沉淀和Western杂交在哺乳动物细胞COS-7中确证诱饵蛋白和候选蛋白之间的相互作用. 结果筛选获得一个与HLAⅠ类分子α亚基高度同源的蛋白,这个蛋白在酵母核内以及COS-7细胞中都显示出与CTA1(S63F)的相互作用. 结论 CTA1(S63F)与HLAⅠ类分子α亚基的相互作用可能导致HLAⅠ类分子进入“膜筏“,引起膜筏不断聚集增大,聚集到一定程度后筏相关酪氨酸蛋白激酶活化,启动胞内信号的级联传递,增强免疫反应.
-
免疫佐剂联合中药治疗Hp感染BALB/c小鼠免疫状态的研究
本文研究用SS1Hp株以约109/ml的菌液,每次0.4 ml/只连续灌喂SPF级BABL/c小鼠4次,10 d完成,灌喂后8周经组织学等检查证实全部感染Hp后,随机分成5组,并灌喂:A组尿素酶+霍乱毒素B亚单位(CTB)+羟磷灰石(HAP),B组中药胃泰+尿素酶+CTB+HAP,C组单纯中药胃泰,D组尿素酶,E组为空白对照.
-
霍乱弧菌中存在不含霍乱毒素基因的噬菌体CTXΦ基因组
目的 近年研究发现产毒霍乱弧菌的毒素基因ctxAB由其溶原性噬菌体CTXΦ编码,这种丝状噬菌体可携带ctxAB传递给无毒素基因的霍乱菌株.研究认为ctxAB基因与CTXΦ基因组中的其它基因是严格共存的.然而在本实验室研究中,于不含ctxAB基因的El Tor型霍乱弧菌(EVC)中发现部分菌株含有RS基因同源序列,为此对这些菌株作CTXΦ基因组的进一步研究. 方法 以CTXΦ基因组中的ctxA、ctxB、zot、ace、cep和RS1结构基因制备探针,对ctxAB-菌株染色体作Southern blot检测,并用PCR方法检测CTXΦ的感染受体毒素共调菌毛(Tcp)的tcpA基因. 结果 发现有4株分离自河水的霍乱毒素基因阴性EVC菌株仍含有溶原噬菌体CTXΦ的基因组,为ctxA-ctxB-zot+ace+cep+RS+菌株,另有一株分离自病人的EVC菌株仅表现为RS+.这些菌株均含tcpA基因. 结论 ctxAB基因并不一定与CTXΦ其它基因共存于一个菌株中,发现了在霍乱弧菌中溶原噬菌体CTXΦ基因组内可以不携带毒素基因ctxAB的存在形式.
