高致病性人禽流感H5N1透皮疫苗免疫佐剂的初步筛选

用不同的佐剂与高致病性人禽流感H5N1全病毒疫苗混合,通过透皮途径免疫BALB/c小鼠并评价其免疫应答效果,从而初步筛选出较好的透皮免疫佐剂.实验选用CT、CPG 0DN1826、CpG ODN2006、MF59四种不同的佐剂按适当的比例与高致病性人禽流感H5N1灭活全病毒抗原混合制成透皮疫苗,透皮免疫BALB/c小鼠,检测血清IgG抗体效价、血清中和抗体效价,以及肺、鼻灌洗液中特异性IgG和IgA抗体效价,并对脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4细胞因子水平进行评估.结果显示,在CpG ODN1826单独使用或与CT合用组血清IgG抗体效价较无佐剂组均有显著升高(P<0.05),其中尤以CpG1826+CT+HA组血清IgG抗体效价高,同时血清中和抗体效价也验证了这一点,肺、鼻灌洗液中,均可检测到特异性IgA、IgG.佐剂组与无佐剂组、PBs组、空白对照组相比较,脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的水平均见提高(P<0.05),并且CpG1826+CT+HA组与滴鼻组相比无统计学意义(P-0.2267).结果表明,在高致病性人禽流感H5N1病毒透皮疫苗的小鼠模型中,CT与CPG ODN1826是较好的的透皮免疫佐剂,能够诱导机体Th2型和Th1型免疫应答,同时诱导了黏膜免疫应答的产生,这为进一步研究提供了基础.

弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠抵抗弓形虫感染作用的观察

目的 观察弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠诱导的肠黏膜和系统免疫应答及其抗弓形虫感染作用.方法 BALB/c小鼠52只随机分为两组(每组26只),免疫组小鼠用弓形虫复合黏膜疫苗(每毫升含可溶性速殖子抗原1 mg,霍乱毒素50μg)20μl/只滴鼻免疫2次,间隔2周;对照组用等剂量PBS滴鼻.末次免疫后14 d,各组处死6只,摘眼球取血(0.5～1 ml);取直肠内粪便(4～5粒),ELISA测定血清IgG和粪IgA抗体;分别计数脾组织、派伊尔集合淋巴结(PP)和肠上皮淋巴细胞(IEL),免疫细胞化学法检测各组织中CD4+、CD8+T细胞亚群水平.用RH株弓形虫速殖子(4×104个/只)灌胃攻击感染各组其余小鼠,30 d后颈椎脱位处死,计数肝、脑组织速殖子虫荷.结果 免疫后14 d,免疫组小鼠血清IgG和粪IgA抗体水平(分别为0.224和0.371),显著高于对照组(分别为0.041和0.037)(P＜0.05),脾、PP和IEL中T淋巴细胞与对照组相比明显增生(P＜0.01),其中脾、PP中CD4+、CD8+T淋巴细胞增殖显著(P＜0.05),IEL中以CD8+T细胞为主,增殖显著(P＜0.01),CD4+/CD8+比值降低(P＜0.05).攻击后30d,免疫组小鼠存活率(85.0%)显著高于对照组(45.0%)(P＜0.05).免疫组肝、脑组织速殖子数比对照组分别减少86.3%、86.7%,两组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠,能有效诱导黏膜和系统免疫应答,小鼠存活率显著提高,肝、脑组织虫荷显著降低.

甲型H5N1禽流行性感冒病毒血凝素抗原和霍乱毒素B亚单位融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建甲型H5N1禽流行性感冒流感病毒血凝素(HA)抗原和霍乱毒素B亚单位(CTB)融合蛋白真核表达载体,并研究其在COS7细胞中的表达特性,及其在动物体内不同时间点诱导机体产生特异性抗体的情况.方法 采用PCR技术分别克隆CTB基因和HA基因,并用BamH Ⅰ酶切2个基因片段,在T4连接酶的作用下构建CT-HA融合基因(CH基因).双酶切后,将CH基因插入真核表达质粒pCI-neo中,构建甲型H5N1禽流感病毒融合蛋白真核表达载体(pCI-CH).将pCI-CH质粒转染COS7细胞,利用Western印迹、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测HA抗原的表达；间接ELISA法检测免疫接种新西兰大白兔后其血清中HA抗原的特异性抗体效价,以及与H1N1、H9N1、H3N2和乙型流感病毒的交叉反应情况.结果 pCI-CH真核表达载体(即核酸疫苗)构建成功,可在COS7细胞中高效表达,并能在大白兔体内诱导产生特异性抗pCI-CH抗体.核酸疫苗pCI-CH特异性抗血清不仅可以与甲型H5N1流感病毒特异性结合(P/N＞2.1),而且可以与H1N1、H9N1和H3N2毒株发生特异性反应；但该抗血清与乙型流感病毒无特异性反应.结论 构建的甲型H5N1禽流感病毒核酸疫苗具有良好的免疫原性.

我国O139群霍乱弧菌CTX遗传单元基因分布特征

到目前为止,已发生的7次霍乱世界大流行,都是由O1群霍乱弧菌引起的.1992年在印度、孟加拉等国引起暴发流行的O139群霍乱弧菌,是一种新出现的由非O1群霍乱弧菌引起的霍乱流行的病原体,能产生与O1群霍乱弧菌相同的霍乱毒素(CT),其所引起的霍乱在临床和流行病学上也与O1群所致的霍乱基本相同.

口服表达霍乱毒素B亚基/胰岛素原融合蛋白的转基因莴苣和烟草阻止非肥胖糖尿病小鼠胰岛炎的发展

幽门螺杆菌疫苗免疫小鼠的Th免疫应答及作用

目的研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)疫苗诱导小鼠保护性免疫应答的机制.方法以霍乱毒素(CT)加Hp全菌超声粉碎抗原免疫小鼠,并设CT组和生理盐水(NS)组为对照.免疫4周后以Hp攻击;在攻击前后不同时间点分批处死小鼠,比较免疫组和对照组胃黏膜Hp定植及各项免疫指标的变化.结果(1)攻击后5、26周后免疫组和CT组、NS组相比胃黏膜Hp定植量明显降低.(2)各时间点免疫组IgG1、IgG2a、IgA均高于NS组、CT组.(3)攻击前和攻击后5周免疫组和CT组胃黏膜Th1型细胞因子表达较NS组明显升高.攻击后26周免疫组和CT组除白细胞介素(IL)-12外,干扰素(IFN)-γ和IL-2表达均明显降低,而NS组Th1型细胞因子表达明显升高.(4)Th2型细胞因子在攻击前免疫组和CT组胃黏膜均有轻度表达;攻击后5周免疫组和CT组IL-4和IL-10均无表达,IL-6表达低于NS组;攻击后26周免疫组IL-4和IL-10再次表达,CT组仅表达IL-10,IL-6表达各组无明显差异.(5)各细胞因子在所有组脾脏攻击前后各时间点表达无差异.(6)与NS组相比,攻击后5周免疫组鼠胃黏膜出现明显的炎症反应,CT组也有轻度炎症反应;攻击后26周NS组炎症加重而免疫组则有所减轻.结论(1)以CT为佐剂的Hp疫苗可诱导Th1和Th2混合型初始免疫应答;(2)Hp攻击后早期增强的Th1反应起主要免疫保护作用同时导致免疫后胃炎;晚期随Th2反应的增强Th1反应和免疫后胃炎强度减弱.

霍乱毒素B亚单位作为免疫佐剂的研究进展

霍乱肠毒素(CT)是霍乱弧菌重要的毒力因子,内含A和B两个亚单位.A亚单位(CTA)为毒性亚基,B亚单位(CTB)不具毒性.CTB因其独特的生理功能已成为重要的佐剂之一,近年来备受各国学者重视.深入探究CTB的免疫调节机制有助于更好地设计疫苗并优化其效果,此文将对CTB作为免疫佐剂在疫苗研究中的进展进行综述.

免疫分子佐剂ctxB在pVAX1中的初步应用

目的 构建霍乱毒素B亚单位编码基因(ctxB)的真核表达质粒pVAX1-ctxB,并观察其在真核细胞中的蛋白表达情况.方法 利用基因重组技术构建真核表达质粒pVAX1 -ctxB,通过脂质将其转染至CHO细胞中诱导蛋白表达,GM1 -ELISA法检测其蛋白表达产物.结果 重组质粒pVAX1-ctxB经酶切可得到与ctxB大小相同的片段,GM1 -ELISA法证实经转染的CHO细胞可分泌霍乱毒素B亚单位(ctxB)蛋白.结论 成功构建重组表达质粒pVAX1- ctxB,其蛋白表达产物具有ctxB蛋白活性,为下一步加强基因防龋疫苗效价奠定了基础.

重组质粒PcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B在Hela细胞中表达的研究

目的观察重组质粒pcD A3.1-P30-P22-CTXA2/B在Hela细胞中的表达情况,并检测其表达的融合蛋白P30-P22-CTXA 2/B免疫学活性.方法脂质体介导重组真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA 2/B转染Hela细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,收集蛋白行SDS-PAGE和Western-Blot分析,检测融合蛋白的免疫学活性.结果经重组质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B稳定转染的Hela细胞表达了分子量约64KD的融合蛋白,经Western-Blot检测证实该融合蛋白具有P30免疫原性.结论在HeLa细胞中成功表达了具有P30免疫原性的融合蛋白P30-P22-CTXA2/B,为下一步动物实验奠定了基础.

弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A2/B复合基因真核表达质粒的构建

目的选择弓形虫RH株主要表面抗原P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素A2/B亚基共同构建在同一真核表达载体pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确.方法用PCR技术分别从弓形虫RH株基因组DNA和pUAB024-CTXA28/B质粒中扩增编码P30、P22基因片段和CTXA2/B,定向重组入pUC18克隆载体,然后酶切释放P30-P22-CTXA2/B复合基因片段,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,再经含氨苄青霉索的LB培养基筛选、酶切及测序鉴定.结果酶切产物经电泳显示条带清晰,P30、P22和CTXA2/B基因片段的泳动位置分别在786bp、492bp、512bp的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的基因片段方向及序列均正确.结论成功地构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B,保证了三个基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为下一步融合蛋白P30-P22-CTXAA/B在哺乳动物细胞中的表达及动物实验奠定了基础.

安徽省淮南市首起0139霍乱弧菌疫情检测分析

目的 探讨淮南市首起0139霍乱弧菌疫情的发生原因和生物学特性。方法 血清学及常规细菌学方法对菌株进行鉴定，聚合酶链式反应(PCR)检测霍乱毒力基因，改良K-B药敏实验。结果 (1)培养分离及血清凝集试验结果，2例患者粪便标本全部阳性，密切接触者6人肛拭子全部阴性；甲鱼塘水样18份，阳性5份；甲鱼产蛋沙场样9份，2份阳性；甲鱼蛋7份，阳性3份；甲鱼排泄物11份，均为阴性。(2)血清凝集试验阳性培养物对头孢哌酮、强力霉素耐药；对氨苄西林、四环素中敏；对氟哌酸、庆大霉素、环丙沙星等敏感。(3)血清凝集试验阳性培养物霍乱毒素(CT)、毒素协同调节菌毛(TCP)全部阳性。结论 该起0139霍乱弧菌疫情是因甲鱼养殖塘水污染引起，首例患者分离株与该患者所食甲鱼分离株PFGE带型一致，该菌种对头孢哌酮、强力霉素耐药并携带cta、tcpa毒力基因。

用含霍乱毒素A2/B的载体在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原P30

目的克隆并表达含有弓形虫P30抗原及霍乱毒素A2/B亚基基因的原核表达载体,为弓形虫疫苗的研究奠定基础.方法应用PCR方法扩增出P30基因片段后,克隆入含有霍乱毒素A2/B亚基基因的表达质粒pUAB024,在大肠杆菌JM109(DE3)中表达融合蛋白.通过SDS-PAGE电泳及Western blotting进行检测鉴定.结果电泳证明质粒构建正确,SDS-PAGE显示经IPTG诱导可以产生特异性条带,Western blotting进一步证实该条带为P30-CTA2/B融合蛋白.结论 表达载体pUAB024-P30可有效表达特异性的融合弓形虫抗原蛋白P30-CTA2B.

霍乱毒素B亚单位的研究进展

现代生物技术的飞速发展,使传统的疫苗生产方式发生了根本的变化,疫苗研究领域变得异常活跃,人们越来越重视多肽衍生疫苗及疫苗佐剂的发展,融合蛋白作为外源抗原决定簇载体的研究也方兴未艾.将相关抗原融合到合适的载体蛋白上具有毒性小、表达和纯化相对容易的特点,同时可将融合的多肽以确定的构型引入免疫系统之中.霍乱毒素 B 亚单位(CTB)因其独特的生理功能,近年来已成为国内国外研究的热点,将它作为载体蛋白和免疫佐剂产生了很多新的免疫疫苗.

霍乱毒素与粘膜免疫

霍乱毒素(CT)是霍乱弧菌产生的一种不耐热肠毒素,是霍乱弧菌引起腹泻的致病因子,CT具有很好的免疫原性,也是霍乱弧菌疫苗开发中考虑的一个重要候选抗原.另外,CT是很好的粘膜佐剂,在粘膜免疫研究中具有很重要的作用.本文将对CT的粘膜免疫诱导作用作一综述.

融合蛋白弓形虫主要表面抗原P30-CTXA2/B在大肠杆菌中的表达

目的:克隆并表达含有刚地弓形虫主要表面抗原P30及霍乱毒素A2/B亚基基因的原核表达载体,为弓形虫疫苗的研究奠定基础.方法:通过PCR方法扩增出P30基因片段,将其克隆入含有霍乱毒素A2/B亚基基因的表达质粒pUAB024,在大肠杆菌JM109(DE3)中表达融合蛋白.行SDS-PAGE电泳及Western blotting检测鉴定.结果:酶切电泳证明质粒构建正确.SDS-PAGE显示IPTG诱导可以产生特异性条带.Western blotting进一步证实该条带为p30-CTA2/B融合蛋白.结论:成功构建的表达载体pUAB024-p30可有效表达特异性的融合抗原蛋白P30-CTA2/B.

基于霍乱毒素B亚单位结构功能分析的霍乱弧菌基因分型

目的:描述和分类自然发生的霍乱毒素B亚单位DNA和蛋门序列的多态性.及时提供潜在有用的霍乱诊断、疫苗研制和流行病学信息.方法:采用生物信息频谱分析平台,同时包括Clustal W,MEGA和PyMOL分析法,对245个霍乱毒素B亚单位DNA和蛋白序列进行结构和功能及基因分型特性的研究.结果:所分析的霍乱毒素B亚单位的103个氨基酸区域有共同的信息频谱特征,其卡峰特征为F(0.3333,19),显示了霍乱菌株的霍乱毒素B亚单位的共同作用模式.霍乱毒素B亚单位蛋白的T681氨基酸残基关键变异明显增加了F(0.3333)的特征峰高.可能对"人类"作用的模式有较大影响.经过系统聚类分析,发现了19个霍乱毒素B亚单位DNA序列多态.基于以上结果和流行病学资料,提出了19个霍乱弧菌的霍乱毒素B亚单位基因型.霍乱弧菌古典牛物型参考株(569B)的霍乱毒素B亚单位基因型为1a(CTBgenotype 1a).霍乱弧菌埃尔托生物型参考株(N16961)和霍乱弧菌O139血清群的参考株(4260B)的霍乱毒素B亚单位基因型都为2a(CTB genotype 2a).结论:以上内容可对霍乱毒素B亚单位DNA和蛋白序列的多态性提供更好的理解;提供了对霍乱毒素B亚单位分子变异监测的一个技术和方案;可为今后预防和处置霍乱弧菌的感染和流行,进一步扩展了鉴别潜在的免疫、治疗和诊断的分子靶标的可能性.

霍乱毒素及视神经植块对视网膜节细胞存活的影响

目的探讨霍乱毒素及视神经植块对视神经切断后视网膜节细胞存活的影响.方法研究采用荧光逆行示踪标记法和定量解剖学技术.结果 (1)切断视神经5、7及14天后,视网膜节细胞平均密度分别为1 193.8±94.2/mm2、846.9±55.6/mm2及217.5±40.3/mm2.(2)给予霍乱毒素组在5 d、7 d及14 d,视网膜节细胞的密度分别为1 386.3±88.0/mm2,1 196.9±75.2/mm2及396.3±72.4/mm2,与切断视经组相比在各时间段差异均有显著性(P<0.05).(3)玻璃体植入视神经组在5天、7天及14天视网膜节细胞的密度分别为1 367.4±90.8/mm2,1 140.6±83.5/mm2及238.8±37.3/mm2,与对照组相比,在5天及7天组差异有显著性(P<0.05),而14天组差异无显著性(P>0.05).(4)联合给予霍乱毒素及视神经植块,在5、7、14天视网膜节细胞的平均密度分别为1 660.6±93.1/mm2,1 385.6±94.1/mm2及556.4±93.1/mm2,与神经切断组及单纯给予霍乱毒素或视神经组相比,差异均有显著性(P<0.05).结论 (1)CTx和视神经植块都分别能促进受损视网膜细胞存活.(2)联合应用CTx和视神经植块,可显著提高受损视网膜节细胞存活.

弓形虫可溶性速殖子抗原和霍乱毒素滴鼻免疫小鼠诱导的鼻通道细胞免疫应答

目的研究弓形虫可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)和霍乱毒素(cholera toxin,CT)佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠后鼻通道(nasal cavity,NC)的免疫效应及持续时间.方法BALB/c小鼠96只随机分为实验组和对照组,实验组以STAg(20μg/只)为抗原,CT(1 μg/只)为佐剂滴鼻免疫,对照组以PBS滴鼻.滴鼻2次(间隔2周)后分别于第1、2、3、4、6、8、10、12周处死6只小鼠.分离NC的淋巴细胞,计数并涂片,用免疫细胞化学法检测其CD4+T、CD8+T细胞亚群水平.结果小鼠免疫后,NC淋巴细胞第1周至第10周持续显著增生(P＜0.05);NC中CD4+T细胞水平第1周至第8周持续显著增高(P＜0.05),CD8+T细胞在第1、2、3周(P＜0.05)显著增高,持续至免疫后第3周,CD4+/CD8+比值无明显变化.结论STAg和CT佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠可有效诱导NC的免疫应答,并可持续较长时间.

STAg和霍乱毒素不同程序滴鼻免疫小鼠诱导抗弓形虫作用

目的 观察弓形虫可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)和霍乱毒素(choleratoxin,CT)佐剂不同程序滴鼻免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染能力,确定STAg和CT滴鼻免疫的佳程序.方法 BALB/c小鼠随机分为3组:1次、2次和3次免疫组,用20μgSTAg+1μgCT/只分别滴鼻免疫1次,2次或3次,前2次间隔2周,末次间隔1周.末次免疫后第14天,用4×104个速殖子/只灌胃攻击所有小鼠,观察小鼠健康及死亡情况,攻击后第30天处死,ELISA法检测血清IgG和粪便IgA,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子,分离并计数派伊尔结(Peyer's patches,PP)和脾淋巴细胞数.结果 2次和3次免疫组小鼠存活率明显高于1次免疫组(P＜0.05),肝、脑组织内虫荷显著低于1次免疫组(P＜0.001),血清IgG和粪便IgA高于1次免疫组,PP和脾淋巴细胞数无显著性变化.结论 STAg和CT佐剂滴鼻免疫2次或3次能有效诱导小鼠抗弓形虫感染.

霍乱毒素及联合外周神经对视神经损伤后视网膜节细胞再生的影响

目的探讨霍乱毒素(CTx)及其联合外周神经对成年金黄地鼠视神经损伤后再生视网膜节细胞胞体及轴突的影响.方法扎断(MC)成年金黄地鼠视神经(ON)近端,玻璃体内注射CTx,或联合插入小段坐骨神经分支(SN),或切断视神经近端(ONT)并缝接一段自体坐骨神经,并在玻璃体内注射CTx.动物随机分为MC+CTx组、MC+CTx+SN组、ONT+SN+CTx组.各组动物均存活4周.用荧光金逆行标记再生的轴突,在荧光镜下观察视网膜平铺片中再生的视网膜节细胞大小及视神经切片内再生的轴突.结果 MC+CTx组、MC+CTx+SN组、ONT+SN+CTx组再生RGCs周长依次为(56.84±18.08)μm、(83.20±28.28)μm、(94.01±32.44)μm,各组间差异有显著性.再生的RGCs有1～2个轴突,在视神经内多呈波浪状,且多走行在视神经边缘.结论各实验组促进再生的视网膜节细胞大小不同,提示霍乱毒素及其联合外周神经可能促进视网膜不同亚型节细胞再生.