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霍乱毒素B亚单位在乳酸乳球菌食品级表达系统中的分泌性表达
目的 在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)食品级分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ和L.lactis MBP71/pSQ中克隆表达霍乱毒素B亚单位(CTB),实现CTB的分泌性表达.方法 采用PCR扩增霍乱弧菌569B菌株染色体中CTB蛋白编码基因片段,克隆到食品级分泌表达载体pSQZ和pSQ中,转化入宿主菌L.lactis MBP71,构建CTB的分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB;采用Western-blot检测重组菌株中CTB的表达及表达量.结果 PCR扩增得到CTB编码基因片段ctB,酶切、连接到载体pSQZ和pSQ并转化到宿主菌L.lactis MBP71中,构建了分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB.Western-blot检测发现,L.lactis MBP71/pSQ-ctB和L.lactis MBP71/pSQZ-ctB系统均能分泌性表达CTB,L.lactis MBP71/pSQ-ctB上清的表达量约为2 μg/ml;L.lactis MBP71/pSQ-ctB的表达效率远远高于L.lactis MBP71/pSQZ-ctB.结论 成功实现了CTB在食品级表达系统中的分泌性表达.
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霍乱毒素B亚单位与志贺毒素2B亚单位融合表达及抗原性检测
目的 克隆表达出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7志贺毒素2B亚单位(Stx2B)与霍乱毒素B亚单位(CTB)的融合蛋白(CTB-Stx2B),并检测其抗原性和与神经节苷脂(GM1)结合能力.方法 设计引物扩增融合蛋白CTB-Stx2B的编码基因ctb-stx2b,T-A克隆测序验证后克隆入原核表达质粒pET30a(+)C,构建表达质粒pET30a(+)-ctb-stx2b,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达、纯化,获得目的蛋白CTB-Stx2B,SDS-PAGE和Western-blot检测其抗原性和形成五聚体的能力;GM1-ELISA法检测其与GM1结合能力.结果 扩增出约750 bp的目的片段,测序鉴定与设计序列一致;原核表达质粒pET30a(+)-ctb-stx2b转化E.coliBL21(DE3)后,经酶切和PCR扩增鉴定正确;IPTG诱导后SDS-PAGE初步测定CTB-Stx2B单体的相对分子质量(MR)约为20×103;Western-blot检测CTB-Stx2B能与CTB单克隆抗体结合,纯化产物经复性后大多以五聚体形式存在;ELISA检测CTB-Stx2B具有结合GM1活性.结论 成功克隆、表达了融合蛋白CTB-Stx2B;表达的蛋白具有良好的CTB抗原性和GM1结合能力.
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CB-Aβ抗体偶联物抑制痴呆小鼠脑内Aβ纤维斑块形成
目的 研究CB-A3多肽抗体(IgG)是否能高效的进入痴呆小鼠脑内,发挥抑制Aβ纤维斑块形成的作用.方法 用改良过碘酸钠法制备CB-IgG偶联物；鼻腔给予C57小鼠CB-IgG后用问接ELISA法测定脑内抗体量；给予C57小鼠抗体3 h后用间接ELISA测血清和脑区抗体量；5XFAD小鼠分为CB-IgG IN组,IgG IN组,IgG IV组,阳性对照组和阴性对照组,抗体下预14周后,双抗夹心ELISA检测脑内Aβ水平,免疫组化染色观察Aβ沉积和老年斑.结果 鼻腔给予CB-IgG 0.3 h时在脑内即可检测到A3抗体的存在(P＜0.05),3h后达峰值(P＜0.01)；抗体给予3 h后,CB-IgG IN组海马区的抗体量高于IgG IN组和IgG IV组10倍以上(P＜0.05),IgG IV组与IgG IN组脑内的抗体量接近；CB-IgG IN组小鼠脑内Aβ水平比阳性对照组显著降低(P＜0.05)；CB-IgG IN组海马和皮层区的老年斑面积与阳性对照组相比分别减少了80％以上(P＜0.05).结论 鼻腔给予 CB-IgG的方式,在提高抗体入脑量、抑制痴呆鼠脑内Aβ纤维斑块形成等方面均优于其他途径和措施.
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大鼠杏仁内侧核NADPH-d阳性终末的起源
目的探讨一氧化氮合酶(NOS)在杏仁内侧核传入投射神经元中的分布. 方法霍乱毒素B亚单位(CTb)逆行追踪和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)组织化学双重染色相结合的方法. 结果双标神经元(NADPH/CTb)主要分布在中缝背核、蓝斑、臂旁核、导水管周围灰质腹外侧部以及杏仁复合体基底外侧核等神经核团. 结论大鼠杏仁内侧核内的NADPH-d阳性终末主要起源于上述核团,并且提示它们参与杏仁内侧核的功能调节.
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幽门螺杆菌全长cagA基因和霍乱毒素B亚单位基因的克隆与表达
目的构建表达幽门螺杆菌(Hp)细胞毒素相关蛋白(CagA)及粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位(CTB)的重组质粒,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白.方法用PCR方法从幽门螺杆菌扩增CagA基因片段,从霍乱弧菌扩增CTB基因片段,将它们转入原核载体质粒pGEMEX-1,在大肠杆菌DH5α中克隆,并在JM109DE3中表达.结果重组质粒pGEMEX-CTB的全长序列经分析与GenBank公布的序列相符;各表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符;重组蛋白经Western blot检测有较强的抗原性.结论基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于幽门螺杆菌疫苗的研制及检测试剂盒的制备.
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幽门螺杆菌HspA-CtxB口服疫苗的研制及免疫原性研究
目的观察幽门螺杆菌融合蛋白质热休克蛋白A-霍乱毒素B(HspA-CtxB,HCT)经口服免疫在小鼠小肠内的吸收情况及免疫后机体产生的免疫应答. 方法用PCR方法扩增hspA和ctxB 2个目的基因片段,将它们分别克隆至pSK(+)质粒上,然后插入含T7启动子pET-22b(+)的表达载体中,构建含双基因的表达质粒pET-hct,转化E.coli BL21(DE3),经 IPTG诱导表达融合蛋白质HCT;融合蛋白质经镍离子柱纯化、复性后,与HspA重组蛋白质共同标记同位素125I,经小鼠灌胃实验观察其在小鼠小肠内的吸收情况;HCT和HspA分别给小鼠灌胃进行免疫,每周灌胃2次,共8次,末次免疫后3d起收集小鼠粪便,次日眶后静脉采集静脉血,分别对标本进行IgG和IgA检测. 结果经测序,HspA-CtxB(HCT)融合基因片段由726bp组成,为编码242个氨基酸残基的多肽.经SDS-PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量(M)r约为30×103.标记同位素125I的HCT和HspA,经小鼠灌胃实验观察不同时间段的吸收情况,结果发现在10～15min时间段,HCT组出现吸收峰值,约为对照组的8倍以上(P＜0.001),且吸收峰值时间明显提前;将HCT口服免疫小鼠,检测小鼠血清和粪便中的特异性抗体水平.结果HCT组(A405),血清IgA,2.98±0.35,血清IgG, 4.38±0.56,粪IgA, 2.89±0.68;HspA组(A405),血清IgA, 0.38±0.15,血清IgG,0.45±0.16;粪IgA, 0.69±0.23;正常对照(A405),血清IgA, 0.06±0.02,血清IgG, 0.09±0.06;粪IgA, 0.12±0.03. 结论融合蛋白质HCT经口服后可以在小鼠小肠内迅速地被吸收,经口服免疫后可以刺激机体产生较高滴度的特异性抗体.HCT可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的候选口服疫苗株.
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霍乱毒素B亚单位-神经生长因子耦联制剂滴鼻对拟痴呆小鼠空间学习记忆的影响
目的 观察霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit, CB)与神经生长因子(NGF)耦联制剂滴鼻治疗对拟痴呆小鼠学习记忆能力及胆碱能神经系统的影响.方法 用改进的过碘酸钠法使CB-NGF耦联,滴鼻治疗脑室内注射β样淀粉蛋白(Aβ25-35)的拟AD小鼠模型;CB-NGF 7.5 μg/d、15 μg/d滴鼻治疗7 d,Morris水迷宫检测其空间学习记忆能力;免疫组织化学染色胆碱乙酰化酶(ChAT).结果 未经治疗的模型鼠寻台潜伏期明显延长(P<0.01);在安全岛所在象限的停留时间明显缩短,斜角带区ChAT阳性细胞数量显著减少(P<0.001).NGF及CB-NGF滴鼻治疗组寻台潜伏期有所缩短,在安全岛象限内的停留时间比模型组明显延长(P<0.01);基底前脑斜角带区ChAT染色明显增多(P<0.01).结论 CB-NGF滴鼻治疗可改善痴呆小鼠的空间认知能力,与其保护胆碱能神经有关.
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CTB-mST2融合蛋白在大肠杆菌表达及其生物活性鉴定
目的:表达霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌突变的热稳定肠毒素(mST)的融合蛋白,并进行抗原性和免疫原性的分析.方法:通过连接肽(linker)将CTB基因和串连的mST连接,然后插入表达载体pET-22b(+),获得克隆,经IPTG诱导获得CTB-mST2融合蛋白.采用多因素正交优选法优化了培养基及培养条件,对表达产物进行包涵体复性后,经过亲合层析纯化得到融合蛋白,并对该融合蛋白抗原性和免疫原性进行了分析.结果与结论:构建了高效表达工程菌,经摇瓶培养,在优化培养基及培养条件下融合蛋白表达量可达320 mg/L,占总蛋白40%.融合蛋白免疫小鼠,可获得高滴度抗CTB和ST血清;将融合蛋白与灭活的O157∶ H7菌体组合免疫小鼠,可产生对O157∶ H7毒株攻击的保护力.本研究可为构建抗ETEC和EHEC复合疫苗提供依据.
关键词： 霍乱毒素B亚单位 大肠杆菌热稳定肠毒素 大肠杆菌O157:H7 疫苗 -
NOS在大鼠杏仁皮质核传入神经元内的分布
目的研究一氧化氮合酶(NOS)在杏仁皮质核传入投射神经元中的分布.方法采用霍乱毒素B亚单位(CTb)逆行追踪和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)组织化学双重染色相结合的方法.结果双标神经元(NADPH/CTb)主要分布在孤束核(Sol)、蓝斑(LC)、臂旁内侧核(MPB)、中缝背核(DR)、中央灰质外侧部(CGL)、中央灰质背侧部(CGD)、丘脑室旁核(PV)、下丘脑室旁核(Pa)、下丘脑室周核(Pe)、下丘脑腹内侧(VMH)核以及杏仁内侧核(ME)等神经核团.结论NOS在大鼠杏仁皮质核传入投射神经元中主要分布于上述核团,并且提示NO参与杏仁皮质核的功能调节.
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幽门螺杆菌重组vacA-CtxB蛋白的原核表达及免疫学研究
目的 原核表达幽门螺杆菌pQE-vctB(含H.pylori细胞空泡毒素毒性片段与霍乱毒素B亚单位的融合基因)在E.coil DH5α中诱导表达,以获得重组蛋白,鉴定其抗原性和免疫原性,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础.方法 (1) pQE-vctB转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达重组蛋白VCTB,Western blot分析抗原性,镍离子柱纯化.(2)重组蛋白VCTB口服免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性IgG、小肠冲洗液IgA,以鉴定其免疫原性.结果 重组蛋白VCTB经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为40 kD,亲和层析后可获得纯度为92％以上的蛋白.Western blot分析显示能与VacA抗血清反应.ELISA检测显示,免疫小鼠的血清特异性抗体IgG,肠粘液IgA显著高于VacA对照组(P＜0.01).结论 vacA和ctxB融合基因原核表达质粒转化E.coli DH5α表达菌获得了重组蛋白VCTB,表达量较高,纯度较高,有良好的抗原性和免疫原性,口服免疫小鼠可明显提高其免疫效果,产生较高水平的IgA,可用于制备防治H.pylori感染的口服疫苗.
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幽门螺杆菌HpaA-CtxB融合蛋白的表达及其免疫原性研究
目的:探讨幽门螺杆菌融合蛋白粘附素-霍乱毒素B亚单位(HpaA-CtxB,HCTB)经口服免疫小鼠后,机体产生的免疫应答.方法:用PCR方法扩增HpaA和CtxB两个目的基因片段,将它们分别克隆至pET-32a(+)和pQE-30质粒上,然后同时插入pQE-30表达载体中,构建含双基因的的表达质粒pQE-HCTB,转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白HCTB;Western blot分析其免疫反应性.融合蛋白经镍离子柱纯化后,HCTB和HpaA分别给小鼠灌胃进行免疫, ELISPOT和ELISA分别检测小鼠胃粘膜、派伊尔小结(Peyer′s patches, PP)抗原特异性抗体分泌细胞(ASC),和血清IgG、IgA、小肠粘液sIgA和粪便sIgA.结果:经测序HCTB融合基因片段由1 161 bp组成,为编码387个氨基酸残基的多肽.经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为 40 000.可溶性表达占全菌的25%以上,经亲和层析后可获得纯度为92%以上的重组蛋白.Western blot分析其能分别与HpaA抗血清和CT抗血清特异性反应.灌胃免疫小鼠后ELISPOT和ELISA检测结果,胃和PP sIgA-ASC、IgG-ASC数量明显增加,尤以sIgA-ASC为甚,同时血清IgA、IgG,粪sIgA,肠粘液sIgA也明显高于HpaA组和对照组(P＜0.05和P＜0.01).结论:融合蛋白HCTB经口服免疫可有效诱导粘膜免疫应答,产生高水平的sIgA,发挥局部粘膜免疫作用.HCTB可作为集预防和治疗为一身的Hp候选口服疫苗.
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幽门螺杆菌融合蛋白HCTV的保护性研究
目的 探讨幽门螺杆菌融合蛋白HCTV(HpaA-CtxB-VacA, HCTV)小鼠口服后的免疫应答.方法 以Ni2+-NTA柱纯化HCTV为抗原,与重组蛋白HpaA和VacA分别给小鼠灌胃免疫,ELISPOT检测小鼠胃黏膜和派伊尔小结(Peyer patches, PP)特异性抗体分泌细胞(Antibody-secreting cells,ASC),ELISA检测血清IgG和IgA、小肠黏液sIgA和粪便sIgA.结果 ELISPOT和ELISA检测结果表明,胃黏膜和PP sIgA-ASC、IgG-ASC数量明显增加,尤以sIgA-ASC为甚,同时血清IgA和IgG、粪便sIgA、肠黏液sIgA也明显高于HpaA组、VacA组和对照组,差异均有显著意义.结论 已成功获得纯化的融合蛋白HCTV,小鼠灌胃免疫可有效诱导黏膜免疫应答,产生高水平的sIgA,可作候选Hp口服疫苗.
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一氧化氮合酶在大鼠杏仁基外侧核传入神经元内的分布
目的:研究一氧化氮合酶(NOS)在大鼠杏仁基外侧核(BLA)传入投射神经元中的分布.方法:采用霍乱毒素B亚单位(CTb)逆行追踪和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)组织化学双重染色相结合的方法. 结果:双标神经元(NADPH -d/CTb)主要分布在孤束核、蓝斑、臂旁内侧核、中缝背核、中央灰质背侧部、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、下丘脑室周核、下丘脑腹内侧核以及杏仁内侧核等神经核团.结论:NOS在大鼠BLA传入投射神经元中主要分布于上述核团,并且提示NO参与BLA的功能调节.
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变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因在转基因番茄中的表达
目的:在获得含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄原代种子的基础上,应用分子生物学技术检测外源基因在转基因植株中的表达,测定目的蛋白的含量.方法:PCR筛选含编码变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄植株;提取番茄果实总蛋白,用BCA试剂盒测定番茄果实总蛋白含量;通过Western印迹检测外源蛋白的表达情况,并用ELISA法对外源目的蛋白含量进行测定.结果:PCR扩增分析可见1.6 kb特异性扩增条带,出现特异性条带的植株占总检测植株的55.6％;转基因番茄总蛋白含量为3.93 mg/mL,Western印迹结果显示,在PVDF膜上,约60 kD处出现特异性条带;ELISA测得表达的目的蛋白占番茄可溶性总蛋白的0.18％.结论:含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白.
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霍乱毒素B亚单位与胰岛素B链结构类似多肽融合蛋白的制备
为了在大肠杆菌中表达霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)与胰岛素B链(9-23)肽段结构类似多肽(Ins B(9-23))的融合蛋白,使用基因工程方法构建了CTB与Ins B(9-23)的融合基因CTB-Ins B-X若干,并将融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3).重组菌株经乳糖诱导后,其表达产物经过12％ SDS-PAGE分析表明该菌株可以包含体形式表达融合蛋白,并制备得到纯度较高的重组蛋白.该重组蛋白的包含体经过变性、复性后,可以在体外自组装成五聚体结构.GM1 -ELISA分析结果表明,重组蛋白在体外可以与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异性结合,表明该融合蛋白保持了CTB形成五聚体的生物活性.
关键词： 霍乱毒素B亚单位 胰岛素B链(9-23)肽段 包含体 五聚体 神经节苷脂GM1 -
霍乱毒素B亚单位与p277融合基因在大肠杆菌中表达及免疫分析
为了增强多肽表位的免疫原性,构建了霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)和p277的融合基因CTB-p277,将该融合基因克隆到pET28a(+)中,获得原核表达载体pET28a-CTB-p277;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经2%的乳糖诱导5 h后的表达产物用12%的SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,融合蛋白占全菌蛋白约40%,且主要以包含体的形式存在.包含体经洗涤、裂解,用DEAE纤维素离子交换纯化,可以获得99.1%的重组蛋白.重组蛋白的包含体经复性后,在体外可以自组装成五聚体.重组蛋白免疫KK-Ay小鼠后,ELISA的分析表明可以产生抗p277的抗体.血糖和体重的测定结果显示,给药组小鼠的血糖有明显的降低,体重也有相应的减轻.同时GM1-ELISA的检测表明,CTB-p277在体外可以和神经节苷脂GM1(Monosialoganglioside)特异结合,具有生物活性.
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一种谷氨酸脱羧酶65相关肽融合蛋白的制备及其治疗1型糖尿病的药效研究
使用基因工程方法构建了霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)与谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxylase 65,GAD65)串联三肽GADⅢ(包括p217-236,p524-538,p290-306)合基因CTB-GADⅢ.将融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3).重组菌株经乳糖诱导后,其表达产物经过15%SDS-PAGE分析表明该菌株可以以包涵体形式表达融合蛋白,Mr约为17.6 k.含有CTB-GADⅢ重组蛋白的包涵体经过变性、复性、纯化后,可以得到五聚体结构的CTB-GADⅢ.神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)结合实验表明重组CTB-GADⅢ蛋白可以与GM1特异性结合,表明该融合蛋白保持了CTB形成五聚体的生物活性.使用该重组蛋白在NOD小鼠周龄、10周龄和12周龄时滴鼻免疫小鼠共3次,可以显著降低小鼠的发病率,达到治疗1型糖尿病的作用.
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热休克蛋白65及其两个功能表位在调节动脉粥样硬化中的作用
动脉粥样硬化是一种自身免疫性疾病.人自身热休克蛋白60是主要的自身免疫原之一,能引起人自身免疫性反应进而促进动脉粥样硬化的发生,热休克蛋白65与人热休克蛋白60有较高的同源性,同源性为46%左右,具有相似的抗原表位,通过诱导粘膜免疫耐受产生抗炎效果将会对动脉粥样硬化产生积极的影响.热休克蛋白65鼻黏膜免疫动脉粥样硬化模型新西兰大白兔,能显著减轻主动脉粥样斑块,与PBS组存在极显著差异(P＜0.01).热休克蛋白65上31～46片段,180～188片段与霍乱毒素B亚单位的融合蛋白鼻黏膜免疫动脉粥样硬化模型新西兰大白兔,不能显著减轻主动脉粥样斑块,与PBS组不存在显著性差异(P＞0.05).结果表明HSP65鼻黏膜免疫新西兰大白兔能有效诱导兔黏膜免疫耐受,预防动脉粥样硬化;热休克蛋白65上31～46片段和180～188片段,虽然有文献报道通过诱导免疫耐受在小鼠自身免疫性疾病佐剂性关节炎中有很好的预防作用.但在动脉粥样硬化中却不能有效诱导黏膜免疫耐受而显著改善病情.
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免疫分子佐剂ctxB在pVAX1中的初步应用
目的 构建霍乱毒素B亚单位编码基因(ctxB)的真核表达质粒pVAX1-ctxB,并观察其在真核细胞中的蛋白表达情况.方法 利用基因重组技术构建真核表达质粒pVAX1 -ctxB,通过脂质将其转染至CHO细胞中诱导蛋白表达,GM1 -ELISA法检测其蛋白表达产物.结果 重组质粒pVAX1-ctxB经酶切可得到与ctxB大小相同的片段,GM1 -ELISA法证实经转染的CHO细胞可分泌霍乱毒素B亚单位(ctxB)蛋白.结论 成功构建重组表达质粒pVAX1- ctxB,其蛋白表达产物具有ctxB蛋白活性,为下一步加强基因防龋疫苗效价奠定了基础.
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细粒棘球绦虫重组CTxB-Eg95(TP)融合蛋白的原核表达
目的 构建CTxB-Eg95(TP)融合基因原核表达载体,并诱导表达CTxB-Eg95(TP)融合蛋白.方法 采用PCR技术分别克隆CTxB基因和141bp的Eg95基因片段序列Eg95(TP)并鉴定.分别将两个基因片段定向克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中,构建pET-CTxB-Eg95(TP)重组质粒.将鉴定为阳性的重组质粒转化E.Coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳鉴定.结果 测序结果表明已成功构建CTxB-Eg95(TP) 融合基因的原核表达载体,SDS-PAGE电泳结果显示,转染pET-CTxB-Eg95(TP)的E.Coli BL21(DE3)菌经IPTG诱导可表达大小约23.5kDa的特异蛋白条带,与预期结果一致.结论 CTxB-Eg95(TP) 融合基因获得了高水平的表达,为Eg95的表位研究和应用于口服疫苗奠定了基础.
关键词： Eg95(TP)基因序列 霍乱毒素B亚单位 融合基因 原核表达
