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提高可唯适(R)推广使用的良性运行效果研究
[目的]提高可唯适(R)推广使用的良性运行程度,获得预期的预防接种效果.[方法]对可唯适(R)推广使用的全过程进行关键控制点分析,并实施针对性控制.[结果]科学提高海员、出国劳务人员、麦加朝觐人员、野外工程技术人员、国际维和部队以及旅行人员抵御感染霍乱的能力.[结论]只有正确推广使用可唯适(R),才能获得预期的效果.
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基因重组幽门螺杆菌HspA-Zot融合蛋白质口服疫苗的研制
目的制备幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(HspA)和霍乱弧菌封闭小带毒素(Zot)的重组融合蛋白质HspA-Zot(HZ);观察融合蛋白HZ经口服免疫后在小鼠小肠内的吸收情况;观察HZ经口服免疫后诱发小鼠产生的特异性免疫应答反应.方法①用PCR方法扩增HspA和Zot两个目的基因片段,将它们分别克隆至pSK(+)质粒上,然后插入含T7启动子pET-28a(+)的表达载体中,构建含双基因的表达质粒pET-hz,转化E,coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达高效的融合蛋白HZ;②融合蛋白经镍离子柱纯化、复性后,与HspA重组蛋白质共同标记同位素125I,经小鼠灌胃实验观察其在小鼠小肠内的吸收情况.结果①经测序,hspA-zot(hz)融合基因片段由1 575bp组成,为编码515个氨基酸残基的多肽.经SDS-PAGE检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量(M)r约为65×103.②标记同位素125I的HZ和HspA,经小鼠灌胃实验观察不同时间段的吸收情况,结果发现在5～10min时间段,HZ组出现吸收峰值,约为对照组的8.65倍(P＜0.001),且吸收峰值时间明显提前.结论融合蛋白质HZ经口服后可以在小鼠小肠内迅速被大量吸收,经口服免疫后可以刺激机体产生较高滴度特异性抗体.HZ可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的候选口服疫苗株.
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口服轮状病毒疫苗致异常反应的调查研究
轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿严重腹泻的主要原因,并已成为严重的公共卫生问题.目前国内外预防婴幼儿轮状病毒感染性腹泻惟一有效的措施就是口服轮状病毒疫苗.在使用该疫苗的同时,有关副作用如轻度腹泻、发热等时有报道,但因口服疫苗引起轮状病毒性腹泻及喉头水肿致呼吸困难者极为少见,现报告如下.
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黏膜免疫与转基因植物口服疫苗的研究
人体的呼吸道、消化道和泌尿生殖系统都覆盖着黏膜,许多使人致病、致死的病原体大都可经黏膜侵入人体,因此,研制口服疫苗具有深远的意义.与注射疫苗相比,口服疫苗不仅能诱导黏膜免疫反应,也能诱导系统免疫反应,且避免了由注射器可能带来的疾病传染.随着基因工程的飞速发展和植物转化技术的完善,利用植物生物反应器可生产方便、廉价、有效、不需纯化就可直接口服的疫苗[1,2],即通过抗原蛋白基因在植物可食部位的表达,直接食用后激发人体黏膜免疫系统产生抗体,预防疾病.这种新型口服疫苗改变了传统的疫苗生产方式和接种手段,大大降低了疫苗的生产成本,给免疫预防领域带来了新的生机.
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云南省德宏州1995～2000年急性弛缓性麻痹病例监测及流行病学分析
为了消灭脊髓灰质炎(脊灰),1993～2000年进行了7次全国统一的强化口服疫苗(服苗)工作.本州服苗累计79.78万人次,用州统计局的人口数推算和CMR法测算,每年4岁以下儿童服苗率平均达到94.98%,流动儿童服苗50 966人次,缅甸儿童服苗3 395人次.现将我州1995～2000年急性弛缓性麻痹(AFP)病例流行病学情况分析如下.
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人类肠道病毒71型亚单位疫苗壳聚糖佐剂作用的研究
为了解人类肠道病毒71型(EV71)重组保护性衣壳蛋白(rVP1)亚单位疫苗壳聚糖佐剂的作用,本研究利用rVP1蛋白与壳聚糖佐剂制备的疫苗口服免疫新西兰白兔,通过ELISA方法检测兔血清、粘膜洗液(小肠、鼻腔和肺)及粪便中特异性IgG、IgA抗体水平,中和试验检测血清中和抗体滴度,并通过抗原刺激体外培养的兔脾淋巴细胞分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平评价rVP1口服免疫效果.结果显示,单纯口服rVP1蛋白仅可诱导产生较低水平的血清IgG和粘膜IgA抗体,而含佐剂疫苗组与单纯抗原免疫组差异显著,并可诱导产生中和抗体.细胞免疫检测结果显示rVP1含佐剂组兔脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4水平明显高于未加佐剂组.本研究为研制EV71VP1口服疫苗奠定了基础.
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乙型肝炎病毒表面抗原基因在墨西哥酸浆中的表达及其免疫原性的初步研究
以墨西哥酸浆子叶作为外植体,与农杆菌EHA105(含质粒p1301HBs)共培养3天,通过延迟筛选的方法用潮霉素加压直接诱导成芽,抗性芽经诱导生根获得转化植株.经PCR、Southern点杂交等分子检测,证实目的基因已整合到墨西哥酸浆基因组中.ELISA检测证实了在墨西哥酸浆中表达的HBsAg具有较好的活性.初步比较了目的基因在转化植株、不同器官的表达水平差异.取注射初免1次但抗体水平明显下降的Babl/c小鼠,口服饲喂加强免疫,有明显的特异性抗体回升反应.表明转基因墨西哥酸浆疫苗作为口服加强免疫具有重要的理论和实用价值.
关键词： 墨西哥酸浆 遗传转化 口服疫苗 乙型肝炎病表表面抗原(HBsAg) -
流感口服疫苗研究进展
流感疫苗接种始于20世纪40年代,在人群中长期和广泛的接种数据表明流感疫苗接种是防控流感有效的手段.传统疫苗的存在形式包含全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗.它们存在的局限性主要包括:(1)依赖于鸡胚生产,耗时较长;(2)不良反应较大;(3)匹配性依赖:若疫苗株与流行株不相匹配,会造成免疫逃脱,严重影响人群免疫效果;(4)监测干扰:机体会产生针对于病毒内部蛋白(如NP)的特异性抗体,所以全病毒疫苗的使用会干扰临床监测和检疫及流行病学调查.
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幽门螺杆菌HspA-CtxB口服疫苗的研制及免疫原性研究
目的观察幽门螺杆菌融合蛋白质热休克蛋白A-霍乱毒素B(HspA-CtxB,HCT)经口服免疫在小鼠小肠内的吸收情况及免疫后机体产生的免疫应答. 方法用PCR方法扩增hspA和ctxB 2个目的基因片段,将它们分别克隆至pSK(+)质粒上,然后插入含T7启动子pET-22b(+)的表达载体中,构建含双基因的表达质粒pET-hct,转化E.coli BL21(DE3),经 IPTG诱导表达融合蛋白质HCT;融合蛋白质经镍离子柱纯化、复性后,与HspA重组蛋白质共同标记同位素125I,经小鼠灌胃实验观察其在小鼠小肠内的吸收情况;HCT和HspA分别给小鼠灌胃进行免疫,每周灌胃2次,共8次,末次免疫后3d起收集小鼠粪便,次日眶后静脉采集静脉血,分别对标本进行IgG和IgA检测. 结果经测序,HspA-CtxB(HCT)融合基因片段由726bp组成,为编码242个氨基酸残基的多肽.经SDS-PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量(M)r约为30×103.标记同位素125I的HCT和HspA,经小鼠灌胃实验观察不同时间段的吸收情况,结果发现在10～15min时间段,HCT组出现吸收峰值,约为对照组的8倍以上(P＜0.001),且吸收峰值时间明显提前;将HCT口服免疫小鼠,检测小鼠血清和粪便中的特异性抗体水平.结果HCT组(A405),血清IgA,2.98±0.35,血清IgG, 4.38±0.56,粪IgA, 2.89±0.68;HspA组(A405),血清IgA, 0.38±0.15,血清IgG,0.45±0.16;粪IgA, 0.69±0.23;正常对照(A405),血清IgA, 0.06±0.02,血清IgG, 0.09±0.06;粪IgA, 0.12±0.03. 结论融合蛋白质HCT经口服后可以在小鼠小肠内迅速地被吸收,经口服免疫后可以刺激机体产生较高滴度的特异性抗体.HCT可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的候选口服疫苗株.
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HCMV pp150抗原基因在蚕豆中的遗传转化及鉴定
目的 研制人巨细胞病毒(HCMV)口服疫苗.方法 根据HCMV基质磷蛋白PP150基因序列设计引物,PCR法从HCMV ADl69株基因组DNA中扩增出编码PP150抗原决定簇区域的基因片段.将Kozak序列插入PP150基因的起始密码子的上游,3'端引入了内质网滞留信号KDEL序列,将修饰后的基因片段克隆进载体pB1121,构建了带潮霉素(Hyg)选择抗性基因的植物表达载体pCAM BIA1300/pp150和根癌农杆菌工程菌EHA105;采用叶盘法转化蚕豆,获得了5株抗性植株,通过PCR、Southern blot和RNA dot blot分析鉴定,确认了3株为转基因植株.通过ELISA和Western blot对这3株的蛋白萃取物进行分析,以鉴定其免疫学活性.结果 这3株转基因植株表达的PP150蛋白具有免疫原活性.结论 这些转基因植株为HCMV口服疫苗的研究提供了条件.
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融合表达白细胞介素10与卵清蛋白重组腺病毒口服变应原疫苗的构建及鉴定
目的 构建免疫调节因子白细胞介素(IL)-10与模式变应原卵清蛋白(OVA)融合表达的重组腺病毒载体口服疫苗.方法 直接合成鸡IL-10及OVA的DNA序列后,采用重叠PCR法进行连接.连接序列插入穿梭质粒pHBAd-MCMV的多克隆区,获得重组穿梭质粒pAdIL-10-OVA.经测序鉴定后,pAdlL-10-OVA与腺病毒骨架质粒pHBAd-BHG共转染293细胞,包装获得重组腺病毒AdIL-10-OVA原代病毒,将原代病毒在293细胞中扩增到合适滴度.采用ELISA法检测细胞上清液中融合蛋白的表达水平.结果 重组穿梭质粒插入目标序列经测序鉴定正确,重组腺病毒载体疫苗rAdIL-10-OVA在293细胞中成功表达.结论 成功构建了融合表达IL-10与OVA的重组腺病毒载体疫苗AdIL-10-OVA,为后续动物实验验证其对变态反应性疾病的防治效应奠定了基础.
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N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚基口服基因疫苗的制备和激活SD大鼠产生循环抗体的初步报告
目的研制携带N-甲基-D-天冬氨酸受体1(N-methyl,D-aspartate receptor subunit 1,NR1)的口服疫苗,探讨疫苗激活SD大鼠产生循环抗体的可能性.方法采用聚合酶链反应、酶切连接和蓝白筛选的方法构建NR1的表达载体;以磷酸钙共沉淀的方法转染HEK293细胞,并用G418筛选阳性细胞克隆;应用逆转录聚合酶链反应和免疫荧光细胞染色方法鉴定阳性细胞株;经氯化钙法制备携带NR1表达载体的减毒鼠伤寒沙门(氏)菌口服疫苗(SL-NR1);胃内灌注600 μL、D(λ)260 nm 为0.6 的S L-NR1,2周内4次给药;以阳性细胞株为靶细胞,用免疫荧光方法检测大鼠循环中NR1抗体滴度.结果扩增出NR1基因并构建了含有NR1基因的表达载体--pCDNA3.1-NR1;建立了细胞株 HEK 293-NR1;证实口服疫苗可激活SD大鼠(23/25只)产生NR1抗体.结论成功研制了携带NR1基因的口服减毒鼠伤寒沙门(氏)菌活疫苗,其可激活机体免疫反应产生NR1抗体.
关键词： N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚基 口服疫苗 循环抗体 -
利用groupⅡintron构建产气荚膜梭菌突变体
目的 通过插入失活α毒素基因获得产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)突变体.方法 利用Mobile groupⅡintron的自我剪切作用,对本室保藏的1株野生型C.perfringens的α基因plc插入失活.通过菌落PCR检测,以及观察突变株在哥伦比亚血琼脂培养基和脑心浸液培养基(4%卵黄)平板上的形态变化,进行阳性筛选.蛋白质免疫印迹分析α毒素蛋白活性.结果 PCR检测到α毒素突变体的plc基因中,存在Mobile groupⅡintron片段,并且观察到该菌在哥伦比亚鲜血琼脂平板培养基上的α毒素溶血环消失,在脑心浸液培养基(4%卵黄)平板上无白晕.蛋白质免疫印迹分析表明,plc突变体不表达α毒素蛋白.结论 成功构建C.perfringens α毒素突变体,为后期探索C.perfringens口服疫苗打下了重要基础.
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M细胞模型及其在生物大分子药物口服递药研究中的应用
如何克服胃肠道吸收屏障是蛋白质、多肽和核酸等生物大分子药物口服给药面临的重大挑战.M细胞是胃肠道上皮细胞内一种特殊的抗原摄取细胞,具有高内吞和低降解特征,可能对生物大分子药物的口服吸收发挥重要作用.M细胞体外共培养系统的开发,以及在其基础上建立的体外模型,促进了对M细胞本身以及大分子药物口服给药系统的研究.本文综述了M细胞特殊的结构、功能、形成及生物标志特点,讨论了M细胞体外模型在开发生物活性大分子药物口服给药系统的应用.
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EV71-VP1抗原在双歧杆菌中表达的免疫效果检测
目的 检测表达肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71) VP1基因的重组双歧杆菌免疫后小鼠IgG、IgA表达变化,并对免疫的孕鼠产下的新生小鼠注射EV71病毒,以检测免疫保护作用可否从母代传给子代.方法 ELISA法检测免疫小鼠血清IgG、IgA抗体效价;用EV71毒株对免疫孕鼠所产下的新生小鼠攻毒.结果 两种抗体效价都有明显升高(P＜0.01);实验组受病毒攻击新生小鼠存活率明显高于对照组.结论 口服表达VP1蛋白的双歧杆菌能够激活体内免疫系统产生特异性抗体,重组双歧杆菌可通过免疫孕鼠而使新生幼鼠获得保护性抗体.为研制EV71亚单位口服活疫苗奠定了研究基础.
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基于酿酒酵母表面展示技术构建寨卡口服疫苗及其免疫活性初探
目的:基于酿酒酵母表面展示技术构建具有免疫活性的寨卡病毒(ZIKV)口服疫苗.方法:以Zika/SZ01/2016的包膜(Envelope)基因作为研究对象,以酿酒酵母表面展示质粒pYD1为骨架,构建EBY100/pYD1-Envelope.通过蛋白质印迹法(west-ern blot)、免疫荧光分析和流式细胞仪分析,对Envelope蛋白进行定性分析,通过BCA蛋白测定试剂盒对Envelope蛋白进行定量分析.以SPF级的BALB/e小鼠作为动物模型,考察3种免疫方案(给药方案A:50 OD600nm·d-1×3d,给药方案B:75 OD600nm·d-1×2d,给药方案C:150 OD600nm·d-1×ld)的口服免疫效果.结果:3种免疫方案均能诱发产生较高水平的体液免疫应答和黏膜免疫应答.给药方案C的免疫效果佳.结论:本研究首次探讨了ZIKV口服疫苗的免疫效果,为有效预防ZIKV感染提供了一种可供参考的解决方案.
关键词： 酿酒酵母表面展示技术 Envelope基因 口服疫苗 免疫活性 -
脊髓灰质炎简史
1979年4月26日，世界卫生组织(WHO)宣布人类终于彻底消灭了天花。10年后，1988年世界卫生大会决定将脊髓灰质炎(Polimyelitis,Polio 简称“脊灰”)为人类消灭的第二种传染病。 脊灰是一种常见于小儿的病毒性传染病，由于可致患儿发生迟缓性瘫痪，故又称小儿麻痹症。人类对类似此病的描绘历史虽很久，但是在西方，直到18世纪才把脊灰作为一种疾病定义下来。1793年，英国儿科学家安德伍德(Underwood,M,1737～1820)对该病首次作出科学描述。1840年，德国外科矫形医师海涅(Heine，J，1800～1879)首次对小儿麻痹症的临床表现进行了评论性报告。1870年，著名的法国神经学家沙尔科(Charcot,J.M,1825～1839)应用显微镜研究了患儿脊髓灰质的病理变化并做出详细描述。1909年，美籍奥地利学者兰德斯坦纳(Landsteiner,K,1868～1943)通过实验分离出脊灰病毒并阐明传染途径。1952年，美国病毒学家索尔(Salk,J.E,1914～1995)发明了安全有效的注射疫苗，1955年开始使用。1957年，美国微生物学家萨宾(Sabin,A.B,1906～1993)又发明了口服疫苗，60年代开始普遍服用。从此对肆虐全球的脊灰有了安全有效且易行的预防手段。
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沙门菌Omp D介导的rBCG口服疫苗的制备与鉴定
目的 利用重组BCG (rBCG)技术,构建能以串联和并联形式、在细菌表面表达Der p2和Omp D抗原的两种rBCG 口服疫苗.方法 经PCR法分别扩增获得Der p2和Omp D基因,测序正确后将两者克隆入原核表达载体pProEX HTb,获得pProEX HTb Der p2-Omp D质粒.①串联表达:将Der p2-Omp D融合基因亚克隆入穿梭胞壁表达载体pCW,经酶切鉴定阳性命名为pCW Der p2-Omp D 质粒.将此重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,构建可胞壁串联表达Der p2-Omp D融合蛋白的rBCG；②并联表达:构建pCW-Der p2与pCW-Omp D两种质粒,并将二者同时电穿导入BCG感受态细胞,以构建胞壁并联表达Der p2和Omp D蛋白的rBCG.经潮霉素抗性筛选的阳性克隆,均采用以下三种方式进行鉴定:PCR特异性扩增目的基因片段；用兔抗Der p2多克隆抗体与兔抗Omp D多克隆抗体对阳性克隆分别进行斑点免疫杂交法和间接免疫荧光法鉴定.结果 采用基因工程手段制备出以胞壁形式串联和并联表达Der p2和Omp D蛋白的两种rBCG口服疫苗,并通过PCR、斑点免疫杂交法及间 接免疫荧光法分别进行鉴定.结论 两种rBCG 口服疫苗构建成功,为体外实验和临床应用提供基础.
关键词： Omp D 屋尘螨抗原Der p2 重组BCG 口服疫苗 -
江苏昆山花桥地区婴幼儿轮状病毒腹泻临床及流行病学特点
目的 研究昆山花桥地区＜5岁的婴幼儿轮状病毒腹泻的流行状况及临床特点,为推广轮状病毒口服疫苗及有效控制轮状病毒腹泻提供可靠资料.方法 收集2010年11月-2011年10月,于花桥人民医院就诊的＜5岁的确诊为轮状病毒感染的病例进行流行病学调查和临床观察,分析其流行及临床特点.结果 共检测标本112例,其中轮状病毒阳性50例；每年10-11月为发病高峰;12～24月龄发病率高,临床表现以水样腹泻、发热、呕吐为主,常见的并发为呼吸系统症状.结论 轮状病毒感染是昆山花桥地区＜5岁的婴幼儿腹泻的重要原因,加强推广轮状病毒口服疫苗可有效控制及预防婴幼儿腹泻.
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幽门螺杆菌重组vacA-CtxB蛋白的原核表达及免疫学研究
目的 原核表达幽门螺杆菌pQE-vctB(含H.pylori细胞空泡毒素毒性片段与霍乱毒素B亚单位的融合基因)在E.coil DH5α中诱导表达,以获得重组蛋白,鉴定其抗原性和免疫原性,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础.方法 (1) pQE-vctB转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达重组蛋白VCTB,Western blot分析抗原性,镍离子柱纯化.(2)重组蛋白VCTB口服免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性IgG、小肠冲洗液IgA,以鉴定其免疫原性.结果 重组蛋白VCTB经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为40 kD,亲和层析后可获得纯度为92％以上的蛋白.Western blot分析显示能与VacA抗血清反应.ELISA检测显示,免疫小鼠的血清特异性抗体IgG,肠粘液IgA显著高于VacA对照组(P＜0.01).结论 vacA和ctxB融合基因原核表达质粒转化E.coli DH5α表达菌获得了重组蛋白VCTB,表达量较高,纯度较高,有良好的抗原性和免疫原性,口服免疫小鼠可明显提高其免疫效果,产生较高水平的IgA,可用于制备防治H.pylori感染的口服疫苗.
