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风疹病毒E1包膜糖蛋白的结构与功能研究进展
风疹病毒(RV)是致人类先天性畸形的重要病原体之一.其E1包膜糖蛋白在病毒感染及诱导机体免疫反应中起重要作用.对其氨基酸和核苷酸序列结构与蛋白功能的深入研究有助于我们理解RV产生免疫的机理,以研制亚单位疫苗、多肽疫苗等新型疫苗.本文对RVE1糖蛋白结构与功能关系的研究进展进行了综述.
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病毒样颗粒疫苗的研究现状
病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是不含病毒核酸的空壳结构,是由某些病毒的部分结构蛋白过度表达[1]时在细胞内自行组装而成.VLPs与它的源病毒颗粒和亚病毒颗粒(SVPs)有着类似的抗原性,因此VLPs作为候选疫苗是很具潜力的.本文就VLPs作为新一代疫苗的发展现状以及应用潜力加以综述.
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单纯疱疹病毒糖蛋白的特性及其临床意义
单纯疱疹病毒I型(HSV-1)有12种已命名的特异性的抗原糖蛋白,其中大部分具有诱导病毒原发感染的功能,是细胞免疫和体液免疫的主要靶标,也是预防和治疗HSV-1感染的亚单位疫苗或DNA疫苗的候选基因.本文综述了HSV囊膜糖蛋白的特性和其在复制循环中的作用以及其临床意义,为研制预防和治疗单疱病毒性角膜炎的糖蛋白联合疫苗提供了理论基础.
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结核分枝杆菌新型抗原Rv3400的免疫原性研究
目的 用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)特异性抗原Rv3400联合弗氏不完全佐剂(incomplete Freund's adjuvant,IFA)构建结核亚单位疫苗(Rv3400-IFA),在C57BL/6小鼠体内评估其免疫效应.体外用抗原Rv3400感染巨噬细胞RAW264.7并评估其免疫应答.方法 PCR扩增基因Rv3400,构建重组质粒pET28a(+)-Rv3400,转入大肠埃希菌BL21 (DE3) pLysS感受态细胞中,诱导表达并纯化Rv3400蛋白.用抗原Rv3400、阳性对照脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),分别刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,阴性对照为未刺激的巨噬细胞,流式细胞术检测细胞表面分子表达,收集细胞培养上清,ELISA检测细胞因子的分泌.另一方面纯化的Rv3400蛋白与IFA充分乳化构建亚单位疫苗免疫小鼠;C57BL/6小鼠采用数字表法随机分为3组,分别为实验组Rv3400组、阳性对照组Rv3425组、阴性对照组IFA组,每组5只,每2周1次、共免疫3次.分别采用酶联免疫斑点检测技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)和酶联免疫吸附测定(ELISA)技术对免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫进行评估.结果 (1)成功克隆表达并纯化结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400.(2)体外细胞实验结果显示:Rv3400抗原刺激巨噬细胞,其表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表达量显著提高,阳性细胞比率[分别由未刺激的(34.70±2.40)％、(31.25±18.31)％、(41.80±6.01)％、(44.30±0.44)％提高至1 μg/ml Rv3400抗原刺激后的(90.45±7.71)％、(90.10±4.10)％、(89.97±7.79)％、(85.13±5.12)％];能促进细胞分泌高水平的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),分别达(49 217.0±390.61) pg/ml、(1783.4±51.18) pg/ml.(3)免疫小鼠后,ELISPOT结果显示:实验组Rv3400组小鼠分泌INF-γ的斑点形成细胞(spot forming cells,SFC)(136.20±95.09)显著高于阴性对照组(14.00±9.62)(t=2.859,P＜0.01);ELISA结果显示:Rv3400组小鼠T细胞产生TNF-α和IFN-γ的水平[(247.38±142.268)pg/ml、(325.45±75.19)pg/ml)]明显高于阴性对照组[(69.25±60.06) pg/ml、(2.22±1.28) pg/ml(t=2.579,P＜0.05;t=8.597,P＜0.01)];(4)Rv3400组小鼠脾CD4+ CD44high、CD4+ CD62Llow、CD8+ CD44high、CD8+ CD62LlowT淋巴细胞百分比[(44.20±11.95)％,(43.56±11.90)％,(48.88±7.42)％,(47.04±7.72)％]与对照组IFA组[(27.02±6.56)％,(62.60±4.73)％,(30.57±6.00)％,(58.48±6.06)％]相比,差异有统计学意义(one-way ANOVA,F=18.460,F=8.108,F=32.194;F=4.080;P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),呈显著性增加.(5)通过间接ELISA测定免疫后的小鼠血清抗体IgG效价水平高达1:409 600,表明抗原Rv3400也能诱导有效的体液免疫应答;IgG2b/IgG1水平为1.8,说明抗原Rv3400诱导小鼠以Th1型免疫反应为主.结论 亚单位疫苗Rv3400-IFA在C57BL/6小鼠体内可产生较好的细胞免疫和体液免疫效应.结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400有望成为新的结核病疫苗设计及诊断的候选抗原.
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流行性感冒灭活亚单位疫苗和裂解疫苗的安全性和免疫原性的比较研究
目的比较流感亚单位疫苗与裂解疫苗的安全性和免疫原性.方法流感亚单位疫苗和裂解疫苗按随机双盲法分别接种249名和250名6～12岁健康儿童.于接种当日和接种后3天内观察局部反应和全身反应.用血凝抑制试验检测接种儿童免疫前后的血凝抑制抗体(HI)滴度,计算抗体4倍增长阳转率,免疫后的保护水平抗体(≥1∶40)的免疫成功率,以及抗体几何平均滴度(GMT)值和增长倍数.比较流感亚单位疫苗和裂解疫苗的临床观察结果. 结果两种疫苗接种后均未见局部反应,发热反应率和中高度发热反应率亚单位疫苗低于裂解疫苗,两组的差异有显著的统计学意义.未见其他全身反应.对疫苗3个毒株的血清学检测结果显示:亚单位疫苗的阳转率为74.5%～95.1%,保护水平抗体的免疫成功率为94.2%～99.6%,抗体GMT增长倍数为5.4～21.2.裂解疫苗的阳转率为79.8%～97.8%, 保护水平抗体的免疫成功率为96.4%～100.0%, 抗体GMT增长倍数为6.4～21.0.两种疫苗的免疫学效果相似,所见差异无显著的统计学意义.结论流感亚单位疫苗和裂解疫苗接种6～12岁儿童后反应轻微,安全性良好,亚单位疫苗发热反应率低于裂解疫苗.两种疫苗的免疫原性良好,具有同样显著的免疫效果,可以推广使用.
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乙型脑炎病毒样颗粒疫苗的制备及其免疫保护效率的初步评价
将乙型脑炎病毒prME及其信号肽基因片段克隆到穿梭载体AcBacmid中,构建重组穿梭载体AcBac-prME.Lipofectine介导其转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒Ac-prME.Western-blotting、间接免疫荧光试验及电镜观察,证实Ac-prME介导prME在Sf9细胞中高效表达,且形成了病毒样颗粒.小鼠免疫和攻毒试验表明,该病毒样颗粒免疫可以使小鼠获得有效抵抗乙型脑炎病毒强毒株攻击的能力,保护率高达100％,从而为研制基于乙型脑炎病毒样颗粒的亚单位疫苗奠定了基础.
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血吸虫核酸疫苗研究进展
血吸虫病(Schistosomiasis)对人畜危害极大,它的防治是当今血防工作中的一个急待解决的重要课题.目前不少学者倾向于寻求一种有效的血吸虫疫苗,作为综合防治中的主要措施之一,随着现代分子生物学及免疫学的发展,血吸虫疫苗已由灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程重组蛋白疫苗进展到核酸疫苗,这是一种新型疫苗,同分子疫苗一样,也属于一种亚单位疫苗.本文拟在核酸疫苗及其在血吸虫方面的研究进展方面做一综述.
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接种流行性感冒亚单位疫苗引起血小板减少性紫癜1例报告
患者,女,34岁,于2006年10月17日10:00在某社区卫生服务中心按照操作规程要求,经过排查禁忌证、进行接种疫苗书面告知及皮肤严格消毒后,在左上臂三角肌肌内注射凯荣有限公司生产的流行性感冒(流感)亚单位疫苗0.5ml(批号068901,有效期至2007年6月).
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呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV) 是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染如支气管炎和肺炎的常见病原体,导致患者住院治疗甚至死亡.虽然RSV疫苗的研究已有近60年历史,但依然没有商品化的疫苗可用.近年来,随着RSV分子生物学研究的深入和新型疫苗设计策略的应用,RSV疫苗研究进展迅速.目前正在研制多种针对不同免疫对象的候选疫苗,包括减毒活疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗和纳米颗粒疫苗等,其中亚单位疫苗和纳米颗粒疫苗适用于孕妇和老人,减毒活疫苗、载体疫苗和部分亚单位疫苗有望用于婴幼儿.本文介绍了RSV的生物学特性、 RSV疫苗研究面临的困难和正在进行临床试验的RSV候选疫苗的研究进展,为RSV疫苗的研发提供参考和借鉴.
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流行性感冒裂解疫苗与亚单位疫苗的血清学效果观察
为了观察流行性感冒(流感)亚单位疫苗和裂解疫苗的安全性和血清学效果,选择239名22～66岁(平均37岁)健康人群,分两组于2003年9月接种流感疫苗.第1组接种流感亚单位疫苗,第2组接种流感裂解疫苗,应用血凝抑制试验(HI)检测流感抗体,同时进行临床反应观察.结果显示:接种两组疫苗的发热弱、中反应发生率分别为6.19%、5.55%,接种两组疫苗后3个型别抗体阳转(含HI抗体≥4倍增长)率平均分别为94%～96%、93%～94%、90%～92%.抗体保护水平(≥1:40)亚单位与裂解疫苗均达到100%.接种两组疫苗前后3个型别抗体几何平均滴度增长倍数为:流感亚单位疫苗增长4～6倍,流感裂解疫苗增长4～7倍.两组疫苗不良反应发生率与血清学效果差异均无显著的统计学意义.表明观察的两种流感疫苗均具有良好的安全性和血清学效果.
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弓形虫亲环蛋白亚单位疫苗的免疫保护性研究
目的 研究弓形虫亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)亚单位疫苗的免疫保护性.方法 30只BALB/c小鼠随机分为3组:实验组、佐剂组和PBS对照组,分别肌注pET-28a-TgCyP重组蛋白100 μg/只、佐剂100 ul/只和PBS100 ul/只,共免疫3次,每次间隔2周.末次免疫后2周,各组分别取4只小鼠处死,取脾脏,检测CD4+、CD8+及细胞因子.同时,采用阿尔玛蓝细胞增殖与细胞毒性检测试剂测定小鼠脾淋巴细胞的增殖应答.其余小鼠腹腔攻击感染Rh株弓形虫速殖子500个,观察其存活情况.结果 pET-28a-TgCyP重组蛋白亚单位疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠的CD4+T细胞(62.59±4.17)％、CD8+T细胞(8.53±0.46)％与PBS及佐剂对照组比较显著增殖(P＜0.01),其脾细胞培养液白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)显著升高,小鼠脾淋巴细胞增殖应答显著增强(P＜0.01).弓形虫攻击感染216 h后,实验组小鼠免疫保护率为33.3％,佐剂对照组及PBS对照组小鼠均全部死亡.结论 pET-28a-TgCyP重组蛋白亚单位疫苗具有较强的免疫原性,能产生良好的免疫保护作用.
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乙型脑炎疫苗研究概况
乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的具有高致死率的疾病,其病原体是黄病毒科黄病毒属成员,它感染的脊椎动物物种广泛.人类感染乙型脑炎病毒后严重影响中枢神经系统的疾病.本文着重概述了乙型脑炎病毒的分子生物学结构特点及其当前分子生物学技术条件下乙型脑炎疫苗的研究进展.
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结核新疫苗研究进展
结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种人畜共患传染病.近年来随着结核分枝杆菌多重耐药性菌株(MDR)的增多和艾滋病的流行,结核病死灰复燃,如何有效控制和预防结核病的发生显得尤为重要.卡介苗(BCG)仍是目前人类普遍使用的抗结核疫苗,但其免疫预防效果不甚理想,因此研究新型结核疫苗迫在眉睫,本文就近年来抗结核新疫苗研究的新进展作一综述.
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流感口服疫苗研究进展
流感疫苗接种始于20世纪40年代,在人群中长期和广泛的接种数据表明流感疫苗接种是防控流感有效的手段.传统疫苗的存在形式包含全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗.它们存在的局限性主要包括:(1)依赖于鸡胚生产,耗时较长;(2)不良反应较大;(3)匹配性依赖:若疫苗株与流行株不相匹配,会造成免疫逃脱,严重影响人群免疫效果;(4)监测干扰:机体会产生针对于病毒内部蛋白(如NP)的特异性抗体,所以全病毒疫苗的使用会干扰临床监测和检疫及流行病学调查.
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MPT64--卡介苗重组疫苗的构建
全球有三分之一的人口约20亿感染过结核分枝杆菌,其中1600万人处于活跃期,每年有约1000万新感染者.由于用药的不规范,耐药和耐多药结核病显著增多,增加了治疗的难度;流动人口的增加使结核病的传播机会增加;而艾滋病与结核病合并感染,使问题变的更为严峻.当前预防结核病的卡介苗效果在不同地区有很大差异,改进疫苗的要求提到日程.MPT64是结核分枝杆菌分泌蛋白中含量较多的一种,具有免疫保护力,是亚单位疫苗和核酸疫苗的候选者之一.
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结核分枝杆菌抗原Ag85B-Mpt64190-198-HspX融合蛋白免疫原性的初步观察
目的 为了建立对潜伏感染细菌的保护性免疫应答,本研究选择结核分枝杆菌休眠期、对数生长期重要的保护性抗原HspX、Mpt64的190～198位的氨基酸多肽(CD8+T细胞表位)及Ag85B,构建融合蛋白Ag85B-Mpt64190-198-HspX(AMH),并对其免疫原性进行研究.方法 PCR分别扩增Ag85B、Mpt64190-198-HspX基因,并依次插入pET-28a质粒中,在大肠杆菌BL21中表达纯化AMH蛋白.将该蛋白和佐剂二甲基三十六烷基铵和卡介苗多糖核酸(DDA+BCG-PSN)混合构建亚单位疫苗,分别于1、4、7周皮下免疫C57BL/6小鼠3次,后一次免疫5周后检测体液免疫与细胞免疫反应.结果 该融合蛋白以包涵体形式能在大肠杆菌中稳定表达,经Ni-NTA层析柱纯化得到纯度较高的蛋白;构建的亚单位疫苗免疫动物能产生针对结核杆菌特定抗原(PPD、Ag85B、Mpt64190-198和HspX)的特异性的细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性.结论 融合蛋白AMH作为结核亚单位疫苗候选的融合蛋白抗原有必要进一步研究.
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登革病毒Ⅱ型E基因片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析
目的 分析登革病毒Ⅱ型(DEN2)重组包膜蛋白的免疫原性,为登革Ⅱ型亚单位疫苗的研制奠定基础.方法 扩增DEN2 E基因片段(254～395 AA),与表达载体pET-30a连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白.重组蛋白经高效液相色谱(HPLC)柱纯化后,进行阻断DEN2感染C6/36细胞试验,同时用重组蛋白免疫小鼠,采用中和实验法测定血清中和抗体效价.结果 该基因片段在大肠杆菌中高效表达重组蛋白,重组蛋白可被抗DEN2多克隆抗体识别,纯化后的重组蛋白能有效地抑制DEN2感染C6/36细胞,经重组蛋白免疫的小鼠可产生中和抗体.结论 表达的DEN2重组包膜蛋白具有良好的免疫原性,能诱导中和抗体的产生.
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结核融合蛋白AMM亚单位疫苗强化BCG初始免疫的免疫效应
目的 研究结核融合蛋白Ag85B-Mpt64190-198-Mth8.4(AMM)和佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)、卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)构建的亚单位疫苗强化BCG初始免疫的免疫效应.方法 将融合蛋白AMM、佐剂DDA和BCG-PSN混合构建AMM亚单位疫苗.实验1组BCG初免后第10周用AMM亚单位疫苗加强免疫小鼠一次;实验2组BCG初免后分别于第8周、第10周用AMM亚单位疫苗加强免疫小鼠一次.同时设立生理盐水及仅BCG免疫两个对照组.BCG初免后第14周、第22周,应用ELISPOT、ELISA检测免疫小鼠的细胞及体液免疫反应.同时在第22周用BCG活菌攻击被免疫小鼠,间隔4周后用流式细胞术和ELISA技术检测T细胞分型及体液免疫反应.结果 (1)IFN-γ水平:BCG初免后14周,特异性抗原Ag85B刺激后实验2组分泌IFN-γ的细胞数(135±14)明显高于仅BCG免疫组(194±16),t=10.98,P<0.01;BCG初免后22周,实验2组(208±11)同样高于仅BCG免疫组(57±18),t=6.43,P<0.01.(2)体液免疫应答水平:实验2组的IgGI抗体滴度明显高于实验1组,而作为反映Th1型免疫反应指标的IgG2a/IgG1比值,强化免疫两次组低于强化一次组.(3)BCG模拟攻击被免疫小鼠后,CD4+CD25+调节性T细胞含量:实验1、2组均高于仅BCG免疫组(t1=3.08,t<2>=3.16,P<0.05).结论 BEG免疫-AMM亚单位疫苗加强免疫两次能够引起较强的细胞及体液免疫反应,同时激活调节性免疫反应.
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二甲基三十六烷基铵及卡介苗多糖核酸佐剂在结核亚单位疫苗加强BCG免疫中的效应研究
目的 探讨二甲基三十六烷基铵(dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA)和卡介苗多糖核酸(BCC-PSN)佐剂在结核融合蛋白疫苗加强卡介苗(BCG)免疫中的不同免疫辅助效应.方法 选择DDA、BCG-PSN作为融合蛋白AMM(Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4)的佐剂,在BCG初免小鼠后,AMM疫苗加强免疫两次,其中一组联合使用两种佐剂(DDA/BCG-PSN),另一组单独以DDA作为佐剂,同时设立BCG或磷酸缓冲液(PBS)免疫组为对照.应用ELISA及ELISPOT检测免疫小鼠的体液与细胞免疫反应,后一次加强免疫后第12周,以H37Rv尾静脉攻毒并检测小鼠肺脾组织细菌载量和病理改变,评价不同佐剂疫苗的保护效果.结果 在BCG初免基础上,联合佐剂组(AMM/DDA/BCG-PSN)和单独佐剂组(AMM/DDA)加强免疫两次后,脾脏淋巴细胞经抗原Ag85B和PPD(purified protein derivative)刺激后,皆可产生分泌较BCG组高的IFN-γ.毒力株攻击后菌落形成单位(colony-forming unit,CFU)计数显示,联合佐剂组(AMM/DDA/BCG-PSN)脾脏荷菌量少于PBS组和BCG组(P<0.05);而单独佐剂组(AMM/DDA)肺部荷菌量少于PBS组和BCG组(P<0.05).组织病理分析结果 表明AMM/DDA/BCG-PSN组肺组织病理损伤较轻,而AMM/DDA组病理损伤个体差异较大.结论 DDA是较为理想的结核亚单位疫苗佐剂,能诱导较强的细胞免疫和免疫保护作用;BCG-PSN可能具有免疫调节作用,可以减轻免疫病理损伤.
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细菌菌蜕及其作为疫苗载体的研究
常规疫苗包括灭活苗和减毒苗.新型疫苗主要包括亚单位疫苗、基因缺失苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗等.通过提纯方法,亚单位疫苗可以用于许多微生物疫苗的生产,然而,由于亚单位疫苗的免疫源性很低,所以往往需要添加免疫佐剂才能达到理想效果.
