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血吸虫核酸疫苗研究进展
血吸虫病(Schistosomiasis)对人畜危害极大,它的防治是当今血防工作中的一个急待解决的重要课题.目前不少学者倾向于寻求一种有效的血吸虫疫苗,作为综合防治中的主要措施之一,随着现代分子生物学及免疫学的发展,血吸虫疫苗已由灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程重组蛋白疫苗进展到核酸疫苗,这是一种新型疫苗,同分子疫苗一样,也属于一种亚单位疫苗.本文拟在核酸疫苗及其在血吸虫方面的研究进展方面做一综述.
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日本血吸虫Rho GTPase DNA疫苗及重组蛋白疫苗免疫保护机制初探
目的初步探讨日本血吸虫中国大陆株pcDNA3.1-SjRho GTPase DNA疫苗、重组蛋白疫苗以及联合疫苗免疫的保护机制. 方法将pcDNA3.1-SjRho GTPase DNA疫苗、重组蛋白疫苗分别及联合疫苗免疫昆明鼠后,分不同时间采集血清,以ELISA法测定总抗体及IgG亚类. 结果重组蛋白疫苗及联合疫苗诱导产生的抗体效价较高,DNA疫苗及联合疫苗诱导产生的抗体以IgG2a为主,重组蛋白疫苗诱导产生的抗体以IgG1为主. 结论 Sj-Rho GTPase基因DNA疫苗及联合疫苗主要诱生Th1型细胞免疫应答,重组蛋白疫苗主要诱生Th2型体液免疫应答.
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Myostatin重组蛋白疫苗对小鼠骨骼肌质量和力量的影响
目的:探讨Myostatin重组蛋白疫苗(His-Ms)对小鼠骨骼肌质量和力量的影响及其相关机制.方法:实验动物分为正常对照组和His-Ms组,每组10只.采用基因工程技术表达并纯化的Myostatin无活性蛋白作为疫苗,按100μg/只剂量对His-Ms组小鼠进行免疫,每隔14d免疫1次,免疫4次,共62d.在His-Ms组小鼠进行免疫时,正常对照组腹腔注射相等体积生理盐水.后一次免疫后20d对照组和His-Ms组动物取血样和组织样本,检测血清Myostatin抗体水平及胆固醇(CHO)、甘油三脂(TG)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、肌酸激酶(CK)等血液指标,检测骨骼肌质量和细胞形态等指标.结果:利用高纯度His-Ms重组蛋白作为疫苗免疫小鼠,可诱导小鼠产生特异性抗体,平均抗体滴度在2×102以上.血清中CHO、TG、BUN、GLU和CK等指标两组小鼠间无显著性差别.与正常对照组比较,His-Ms组免疫小鼠体重平均增加了3.6%;股四头肌、腓肠肌和胸大肌重量分别增加了11.2%、3.2%和15.8%,股四头肌横断面积增加了5.6%,而每束肌纤维平均细胞数两组之间无明显差别.His-Ms组免疫小鼠前肢抓力与正常对照组比较平均增加了26.6%,增加显著(P<0.05).结论:Myostatin重组蛋白疫苗免疫使小鼠体重和肌肉质量不同程度增加,抓力明显增强.
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CpG 2006佐剂对呼吸道合胞病毒重组疫苗诱导体液免疫应答的作用
目的 研究CpG 2006佐剂对呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白疫苗诱导的体液免疫应答的作用.方法 重组RSV疫苗G1F/M2与CpG佐剂混合,鼻腔或腹腔注射免疫BALB/c小鼠3次,后一次免疫2周后取血,分离血清,用间接ELISA检测特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a水平.结果 鼻腔免疫途径:CpG佐剂组诱导的IgG1均显著低于无佐剂组(t=3.365,P＜0.05),而IgG2a显著高于无佐剂组(t=2.675,P＜0.05),佐剂组IgG1/IgG2a的比值(1.05)明显低于无佐剂组(1.25).腹腔免疫途径:CpG佐剂组的IgG1明显低于无佐剂组(t=6.869,P＜0.05),而IgG2a显著高于无佐剂组(t=2.893,P＜0.05),且前者IgG1/IgG2a的比值(0.97)明显低于后者(1.30).结论 CpG 2006作为G1 F/M2的佐剂,对体液免疫应答无增强作用,但可以调节免疫应答的类型,使Th1型应答升高,Th2型应答降低.
关键词： CpG 2006 佐剂 呼吸道合胞病毒(RSV) 重组蛋白疫苗 体液免疫应答 -
CpG ODN佐剂对呼吸道合胞病毒重组疫苗诱导的细胞免疫应答的作用
目的:研究CpG2216佐剂对呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白疫苗诱导的细胞免疫应答的作用.方法:重组RSV疫苗G1F/M2与CpG2216佐剂混合,或与CpG2216及常规佐剂Al(OH)3混合,鼻腔(i.n.)或腹腔注射(i.p.)免疫BALB/c小鼠三次,后一次免疫后2周杀小鼠,取脾细胞,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾细胞特异性杀伤活性;用ELISPOT法检测分泌IFN-γ和IL-4的细胞;用流式细胞仪检测CD4+/CD8+效应及LDH记忆细胞.结果:与G1F/M2相比,CpG+G1F/M2鼻腔或腹腔注射免疫均诱导了显著的杀伤活性;而且G1F/M2+Al+CpG(i.p.)诱导的杀伤活性显著高于CpG+G1F/M2(i.p.).ELISPOT结果显示:CpG+G1F/M2鼻腔免疫和腹腔注射免疫组的分泌IFN-γ和IL-4的淋巴细胞数量明显多于G1F/M2组;CpG+Al+G1F/M2(i.p.)组的细胞数显著多于CpG+G1F/M2(i.p.)组;且各组分泌IFN-γ的淋巴细胞数显著多于分泌IL-4的淋巴细胞,即均诱导了Th1型优势应答,有利于宿主抗病毒.流式细胞仪检测结果表明:CpG+G1F/M2(i.n.)仅诱导CD44+单阳性的细胞,而CpG+G1F/M2(i.p.)和CpG+Al+G1F/M2(i.p.)既诱导产生了CD44+单阳性细胞,也产生了CD44+CD62L+双阳性的记忆细胞.结论:CpG2216作为RSV重组疫苗G1F/M2的佐剂,可显著增强细胞免疫应答.
关键词： CpG2216 佐剂 呼吸道合胞病毒(RSV) 重组蛋白疫苗 细胞免疫应答 -
疫苗预防炭疽
背景:炭疽是一种细菌性人畜共患病,偶可引起人类疾病,可能致死.炭疽疫苗包括减毒活疫苗、侣佐剂沉淀无细胞波浪疫苗和重组蛋白疫苗.
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逆向疫苗学及其应用
从18世纪牛痘疫苗诞生至今,人类对疫苗的认识和研制取得了巨大进展.早期的疫苗主要是灭活的全菌体疫苗或灭活的病毒疫苗,随后出现了减毒活疫苗及类毒素.随着关键技术的突破,疫苗种类逐渐增多,产生了亚单位疫苗和重组蛋白疫苗,许多疾病得以很好的控制.但是,这些传统疫苗有其一定的局限性.首先,它们的制备周期长.例如制备亚单位疫苗需要经过许多步骤来鉴定抗原的保护性,再将之用于生产,这个过程通常需数十年时间.其次,这种传统研制疫苗的方法需要在实验室环境中培养病原体,对于不能在实验室条件下生长的病原菌,应用传统方法制备疫苗是不可能的.另外,一些传统疫苗免疫力不持久,对于同一菌种的不同血清型无交叉保护作用.因此,探索出一种快速有效可行的疫苗制备方法是十分有意义的.
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小鼠血管内皮生长因子受体2胞外片段重组蛋白的制备及其初步应用
目的:用基因工程方法获得小鼠VEGFR-2(Flk-1)胞外段与配体结合区域的重组蛋白,并对其应用进行初步的探讨.方法:将经PT-PCR扩增的目的序列组建到原核表达载体并诱导目的蛋白的表达,经纯化后的重组蛋白制备成疫苗,免疫兔,获得抗血清,用ELISA和Western blot方法对抗血清进行分析.结果:目的蛋白在原核表达系统中得到了高效的表达,该疫苗能刺激兔产生抗重组蛋白和天然Flk-1的抗体.结论:该抗血清可用于Flk-1的免疫学检测,也为该疫苗用于抗肿瘤血管生成治疗奠定了基础.
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细胞因子IL-27和CpG ODN佐剂对呼吸道合胞病毒重组蛋白疫苗增强性肺部免疫病理的调节作用
目的 研究细胞因子佐剂IL-27单独或与CPG2216佐剂联合使用对呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白疫苗G1F/M2免疫病理的调节作用.方法 将编码IL-27的质粒(以下简称IL-27)单独或与CPG2216佐剂联合使用与G1F/M2共免疫Balb/c小鼠3次,第3次免疫后第10天用RSV攻击免疫后的Balb/c小鼠,攻毒后5d处死,留取肺组织,用实时定量PCR检测RSV-N基因的表达量,Th1和Th2型细胞因子IFN-y和IL-5,中性粒细胞和嗜酸性粒细胞趋化因子Gro-α和eotaxin,Th1和Th2特异性转录因子T-bet和GATA3及黏液因子gob-5的mRNA的表达量;另一部分肺组织做病理切片,用HE染色观察肺组织情况.结果PBS组明显被RSV感染,而各疫苗组显著被保护.IL-27+G1F/M2组和IL-27+CpG2216+G1 F/M2组的IFN-y表达量无差异(P＞0.05),且均显著高于无佐剂的G1F/M2组(P＜0.05);IL-27+CpG2216+G1F/M2组的T-bet表达量显著高于其它组(P＜0.05);IL-27+CpG2216+G1 F/M2和IL-27+G1F/M2组的GATA3、IL-5表达量均显著低于G1F/M2组(P＜0.05),且IL-27+G1F/M2组的IL-5表达量在疫苗组中低(P＜0.05);IL-27+G1F/M2组的Gro-α、eotaxin、gob-5表达量显著低于其它疫苗组(P＜0.05).病理切片结果显示:与正常小鼠相比,各组经RSV攻击后肺组织均有不同程度的炎症病理损伤,而IL-27+G1F/M2组的肺部的炎症病理损伤与其它各组相比明显减轻.结论IL-27+CpG对疫苗增强性肺部免疫病理有一定的下调作用,而IL-27能显著抑制疫苗增强性肺部免疫病理.
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细胞因子IL-27和CpG ODN佐剂对呼吸道合胞病毒重组蛋白疫苗免疫效果的影响
目的 研究细胞因子佐剂IL-27单独或与CPG2216佐剂联合使用对呼吸道合胞病毒(RSv)重组蛋白疫苗免疫效果的影响.方法 将编码IL-27的质粒(以下简称IL-27)单独或与CpG2216佐剂作为联合佐剂与G1F/M2共免疫Balb/c小鼠3次,每次免疫10d后取血,分离血清,用间接ELISA法测定3次免疫后的血清IgG抗体效价以及末次IgG1、IgG2a抗体效价.第3次免疫后2周处死小鼠,取脾细胞,用LDH法检测CTL活性、ELISPOT法检测分泌IL-4和IFN-γ的淋巴细胞水平、流式细胞仪检测CD4+、CD8+的效应记忆和中央记忆T细胞.结果 ELISA结果表明:除PBS组外,各组均诱导了高水平的IgG抗体无显著性差异(P＜0.05),IgG2a、IgG1分别为Th1和Th2型抗体,IL-27+G1F/M2组、IL-27+CpG2216+G1F/M2组IgG2a和IgG1的比值明显高于其他组,说明IL-27作为佐剂对G1F/M2所诱导的体液免疫应答无增强作用但可以调节免疫应答的类型,使免疫应答更平衡;CTL杀伤实验显示:IL-27+ CpG2216+G1F/M2组的CTL杀伤活性显著高于其他各组(P＜0.05);ELISPOT结果显示:IL-27+CpG2216+G1F/M2组中分泌IFN-γ的淋巴细胞数量显著高于其他组分泌IFN-γ的淋巴细胞数量,且各组分泌IFN-γ的淋巴细胞数量显著高于同组分泌IL-4的淋巴细胞数量(P＜0.05),即均诱导了Th1型优势应答;流式细胞仪检测结果说明IL-27+G1F/M2组和IL-27+CpG2216+G1F/M2组均能诱导产生大量的CD44+CD62L+双阳性细胞.结论 细胞因子佐剂IL-27和CPG2216佐剂联合使用可以增强吸道合胞病毒重组疫苗诱导的细胞免疫应答而且IL-27对Th1型优势应答具有调节作用.
关键词： IL-27 CpG ODN 佐剂 呼吸道合胞病毒(RSV) 重组蛋白疫苗 -
牛Asia I型口蹄疫病毒重组蛋白疫苗的构建及功能研究
目的 为了取代有安全隐患的牛Asia I型口蹄疫病毒灭活疫苗.我们构建了基因工程重组蛋白疫苗.方法 应用PCR方法合成含有表位的基因片段,经过克隆连接获得蕈组基因,在大肠杆菌中表达后经镍亲和层析纯化重组蛋白.重组蛋白免疫豚鼠后,分别经ELISA和乳鼠中和实验检测血清中抗FMDV抗体水平.结果 构建了牛Asia I型口蹄疫病毒重组蛋白疫苗的结构基因.并成功表达和纯化了该重组蛋白.功能实验表明,该蛋白在豚鼠体内诱生了高水平的抗牛Asia I型口蹄疫病毒的中和性抗体.结论 该重组蛋白为制备牛Asia I型口蹄疫病毒新型疫苗提供了有价值的线索.
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重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫血清中功能性抗体OPK检测方法的建立
目的 建立重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫血清中功能性抗体检测方法.方法 在参考美国阿拉巴马大学的多重调理吞噬实验(UAB-MOPA)方法的基础上,构建并鉴定HL-60效应细胞库及金黄色葡萄球菌工作种子批,完成补体浓度、调理和吞噬孵育时间及血清预稀释倍数等关键实验参数的优选.在此基础上对5种不同来源金黄色葡萄球菌进行调理吞噬杀菌(OPK)活性的检测.结果 HL-60细胞经0.8％ DMF诱导分化4d后,CD35表达量为87.1％,CD71表达量为2.82％,活细胞比例为75.7％;靶细菌工作种子批冻存复活率＞90％,工作稀释度＞1 000;体系中补体终浓度确定为6％;选择30 min、60 min作为调理和吞噬孵育时间;血清预稀释倍数为2倍;疫苗免疫血清对5种不同来源的金黄色葡萄球菌均表现出良好的OPK活性及标准的“S”型杀菌曲线.结论 本研究优化建立的OPK检测方法,可有效评价重组金黄色葡萄球菌疫苗的体外功能性抗体水平,为疫苗临床试验样本检测及免疫有效性替代终点的确立提供了重要的技术支撑.
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脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的免疫效果
目的 研究原核重组表达的B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白0315(rNMB0315)在诱导小鼠产生特异性免疫应答中的作用、免疫血清抗体体外杀菌活性和重组蛋白的免疫保护效果,初步评价rNMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的潜力.方法 将构建的原核表达载体pET30a-NMB0315转化大肠杆菌BL21表达重组蛋白,纯化鉴定后的重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,检测体液免疫和细胞免疫水平;测定血清抗体在补体介导下的体外杀菌活性,观察rNMB0315蛋白疫苗对实验小鼠的免疫保护效果.结果 rNMB0315具有良好的免疫原性,能诱导产生较高水平的体液免疫应答:包括血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG3、IgG2b和生殖道黏膜特异性分泌型IgA (sIgA),免疫后第6周抗体效价分别为1∶150 000、1∶85 000、1∶60 000、1∶35 000、1∶30 000和1∶30 000;也能激发较高水平的细胞免疫应答,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的刺激指数(SI)值明显高于PBS、Freund佐剂对照组.在免疫的2、4、6周,血清IgG2a/IgG1比值均小于1,提示rNMB0315疫苗以诱导Th2细胞性体液免疫应答为主.rNMB0315疫苗免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体效价为1∶128;72 h内,对实验小鼠的免疫保护率为90％.结论 原核表达的rNMB0315具有良好的免疫活性和免疫保护效果,NMB0315外膜蛋白具有作为预防B群流脑蛋白疫苗候选抗原的潜力.
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人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗的计算机辅助设计及真核表达
目的:设计并表达预防16型人乳头瘤病毒感染的重组蛋白疫苗.方法:选取HPVl6型病毒L1蛋白上的B表位和T表位,将其连接组合成多种方式,利用计算机预测蛋白质的三维结构,选取其中优的结构进行基因克隆构建,并利用杆状昆虫系统进行表达.结果:利用计算机设计出了一种重组蛋白,成功构建了该重组蛋白的结构基因,并在杆状昆虫表达系统中得到表达.结论:成功构建并表达了人乳头瘤病毒的重组蛋白疫苗.
