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人类肠道病毒71型亚单位疫苗壳聚糖佐剂作用的研究
为了解人类肠道病毒71型(EV71)重组保护性衣壳蛋白(rVP1)亚单位疫苗壳聚糖佐剂的作用,本研究利用rVP1蛋白与壳聚糖佐剂制备的疫苗口服免疫新西兰白兔,通过ELISA方法检测兔血清、粘膜洗液(小肠、鼻腔和肺)及粪便中特异性IgG、IgA抗体水平,中和试验检测血清中和抗体滴度,并通过抗原刺激体外培养的兔脾淋巴细胞分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平评价rVP1口服免疫效果.结果显示,单纯口服rVP1蛋白仅可诱导产生较低水平的血清IgG和粘膜IgA抗体,而含佐剂疫苗组与单纯抗原免疫组差异显著,并可诱导产生中和抗体.细胞免疫检测结果显示rVP1含佐剂组兔脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4水平明显高于未加佐剂组.本研究为研制EV71VP1口服疫苗奠定了基础.
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O型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及纳米样结构观察
目的 本实验旨在高效表达可溶性的O型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒.方法 根据O型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV O/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135个氨基酸铁蛋白(Fn)基因片段,将O型口蹄疫病毒VP1蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒VP1蛋白-铁蛋白基因片段,命名为SeFnt16798.构建了SeFnt16798融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体.分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选高效可溶性表达的SeFnt16798融合蛋白.重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测.结果 实验成功构建9个SeFnt16798表达载体;9个标签中,MBP与SeFnt16798蛋白相融合的可溶性表达效果好,并获得了高纯度的MBP-SeFnt16798重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-SeFnt16798形成了纳米样颗粒.结论 本实验建立了稳定获得SeFnt16798重组蛋白质的方法.
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双歧杆菌肠道内调控表达肠道病毒71型VP1蛋白的实验研究
目的 构建重组肠道病毒71 VP1基因双歧杆菌,制成口服疫苗,用于EV71感染预防. 方法 扩增EV71病毒VP1基因并将其插入到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pBBAD/Xs中,构建VP1表达载体(pBBADs-VP1),通过Western blot检测VP1蛋白在pBBADs-VP1转化菌中的表达.选取BALB/c小鼠,分为B-VP1组、VP1组、GFP组和生理盐水组,B-VP1组口服pBBADs-VP1-转化双岐杆菌,VP1组腹腔注射大肠埃希菌表达纯化的重组VP1蛋白,GFP组口服pBBADs GFP转化双岐杆菌,生理盐水组口服生理盐水,观察pBBADs-VP1-转化双岐杆菌口服免疫对EV71感染的免疫反应:包括病毒的中和抗体滴度、抗EV71-VP1抗体以及诱导脾脏和淋巴集结中Th1免疫反应. 结果 与GFP组及生理盐水组比较,B-VP1组及VP1组中和抗体滴度及抗EV71 VP1抗体水平,均显著增加;口服表达VP1蛋白长双歧杆菌和注射VP1蛋白都会诱导Th1细胞因子免疫反应(P＜0.05),表达VP1蛋白长双歧杆菌较易诱导局部肠道的Th1模式,而注射VP1蛋白较易诱导全身性免疫.攻毒试验显示,VPI和B-VP1组新生鼠攻击后第15 d(剂量1 000 LD50)存活率分别为20.00％和16.67％,对照组无小鼠存活. 结论 利用长双歧杆菌表达VP1蛋白的口服疫苗可能成功激发针对EV71病毒感染的特异性免疫应答.用表达VP1的重组双歧杆菌免疫母鼠,可以赋予新生小鼠以保护.
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鹦鹉热衣原体噬菌体Chp1衣壳蛋白VP1的原核表达及多克隆抗体制备
目的 原核表达并纯化鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)噬菌体Chp1衣壳蛋白VP1的重组蛋白rVP11-190,并制备多克隆抗体. 方法 采用Clustal Omega在线软件对6株衣原体噬菌体VP1蛋白的氨基酸序列进行多重比对,确定Chp1 VP1蛋白的保守区和特异区,并用DNAStar软件预测抗原表位.选择VP11-190与pET28a(+)载体连接构建原核表达载体pET28a-VP11-190,转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达,采用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫ICR小鼠,制备免疫血清,ELISA法检测其抗rVP11-190的效价. 结果 构建的原核表达载体pET28 (a)-VP11-190经IPTG诱导高效表达了相对分子质量约为30×103的重组蛋白.用该蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体血清,ELISA法测定免疫小鼠血清抗体效价为1∶12 800. 结论 成功原核表达并纯化了噬菌体Chp1衣壳蛋白VP11190的重组蛋白,制备的鼠抗VP11-190多克隆抗体血清效价及特异性良好,为进一步分离鉴定鹦鹉热衣原体的噬菌体奠定了基础.
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衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1对沙眼衣原体的作用研究
目的 将原核表达纯化的衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1作用于沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct),以期发现该Vp1蛋白对Ct生长的影响.方法 原核表达并纯化噬菌体phiCPG1的衣壳蛋白Vp1,将纯化后的蛋白复性后与Ct的标准株或临床野生株(终浓度为53μg/ml)室温孵育3h后接种至单层致密McCoy细胞中,培养过程中均加入了了 Vp1蛋白,48 h后碘染色包涵体计数和透射电镜观察Vp1蛋白对Ct生长的影响；MTT法检测Vp1蛋白对McCoy细胞系的细胞毒性作用；液体培养基稀释法检测Vp1蛋白对大肠杆菌BL21和DH5α的抗菌作用.结果 衣壳蛋白Vp1对Q标准株E和D型的抑制率分别为78％和72％,对Ct临床野生株的抑制率为40％～70％,透射电镜结果显示Vp1蛋白能够抑制Ct的正常发育,使包涵体内出现异常增大的网状体.而该Vp1蛋白对非衣原体的其他生物体如大肠杆菌BL21、DH5α和真核细胞McCoy的生长没有影响.结论 噬菌体衣壳蛋白Vp1对Ct的生长具有明显的抑制作用,为临床上Ct感染的治疗提供了新的思路.
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衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1蛋白IN5部分的克隆、表达、鉴定及其对沙眼衣原体抑制作用的研究
目的 探讨衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1蛋白IN5部分在Vp1抑制沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)生长过程中的作用.方法 以Vp1质粒为模板,PCR扩增IN5环基因片段,构建重组质粒pET28a/IN5,转化后诱导表达鉴定,收集纯化的IN5蛋白.将IN5蛋白、Vp1蛋白及各对照组作用于Ct培养过程中,48 h后碘染色及间接免疫荧光进行包涵体计数,采用单因素方差分析比较各组间包涵体均数的差异,若各组均数间差异有统计学意义,采用Bonferroni法对任两个均数进行比较,后计算IN5蛋白和Vp1蛋白对Ct的抑制率.结果 成功地诱导表达出Vp1蛋白的IN5部分,并发现在浓度均为53 μg/mL时,IN5蛋白对Ct的抑制率为52.42%,而Vp1的抑制率为78.04%.结论 IN5蛋白同样对Ct生长有抑制作用,但较Vp1弱,这为寻找Vp1蛋白抑制Ct生长的优势蛋白区域提供了初步探索的经验.
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新型肠道病毒89型结构蛋白VP1的构建表达及序列分析
目的 研究克隆表达新型肠道病毒89型VP1结构蛋白,并进行活性鉴定和序列分析.方法 分离肠道病毒89型VP1结构蛋白全基因,克隆入原核表达载体PET-28构建重组质粒pH-VP1,在大肠埃希菌BL21中进行表达,检测表达产物的特异性及活性.将EV89 VP1核酸序列与Genbank数据库中的序列进行比对并建立系统进化树.结果 重组质粒在l mmol/L的IPTG 37℃诱导7h后可诱导表达得到约33 kD的蛋白,经Western Blot实验检测证明表达的融合蛋白具有EV89抗原的活性.分离的EV89病毒其VP1区核酸序列与Genbank数据库中仅有的3株EV89序列同源性分别为86.4％、85.9％、85.6％.结论 成功构建EV89重组蛋白,其表达产物具有良好的特异性及活性,可进一步用于VP1检测方法的研制.进化分析表明,分离的EV89 VP1区与Genbank数据库中其他分离株亲源性较远.
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柯萨奇病毒A6型VP1蛋白的生物信息学分析
目的：预测柯萨奇病毒A组6型（ Coxsackievirus A6，CVA6）的衣壳蛋白VP1的基本理化性质、结构功能及线性B细胞表位。方法：应用Bioedit软件、SubLoc、TargetP和生物信息学资源门户ExPASy中的多种在线工具对CVA6 VP1的氨基酸序列进行分析。结果：CVA6 VP1为一亲水性蛋白，其相对分子量为33.6 kD，等电点为7.92，含有24个可能的磷酸化位点，没有信号肽、跨膜区和可能的脂酰化位点；其二级结构中以无规则卷曲居多，有48.52％的氨基酸残基暴露于溶液界面；该分子内存在多个潜在的线性B细胞表位，其中的155～165位氨基酸残基区域的抗原指数高。结论：成功预测到CVA6 VP1的基本理化性质、结构功能特征及可能的线性B细胞表位，为该蛋白的进一步研究及疫苗和免疫诊断试剂的研制打下基础。
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柯萨奇病毒B组5型VP1蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备
目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测.方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白.用HisTrap HP亲和层析柱纯化重组蛋白,以纯化的目的蛋白为抗原,免疫雄性SD大鼠获得VP1蛋白多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,微量中和实验测定抗体的中和活性,Western blot检测抗体的特异性,免疫组化检测抗体对组织中抗原的识别.结果:成功构建了VP1-pET-28a重组载体,并且在BL21细胞中成功诱导表达,亲和层析柱纯化后蛋白纯度大于90％.ELISA测得抗体的效价为1:128000,微量中和实验显示抗体没有中和活性,Western blot分析显示抗体能与CVA16和EV71交叉反应,免疫组化实验表明抗体能够识别组织中的CVB5抗原.结论:本研究成功制备了CVB5 VP1蛋白的高效价的多克隆抗体,为CVB5病毒疫苗和病毒诊断的研发提供了有效的工具.
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桃拉综合征病毒VP1高变区蛋白抗体制备及初步特性分析
目的：制备高效价的桃拉综合征病毒主要结构蛋白VP1高变区蛋白抗体，分析其免疫特性，为研究免疫诊断试剂做参考。方法：将pET-VP1重组载体转化入大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下进行表达。重组VP1蛋白纯化后免疫新西兰家兔，用琼脂扩散试验及ELISA检测抗体效价，用与VP1纯化蛋白特异性结合的单克隆噬菌体做竞争抑制试验。结果：pET-VP1重组蛋白在大肠杆菌BL21中呈可溶性高效表达。抗血清经琼扩试验鉴定效价达1∶26，ELISA效价达1∶217。与VP1蛋白特异结合的单克隆噬菌体能阻断部分抗血清与VP1蛋白的结合活性，但不影响终检测阳性的判断。结论：制备的VP1高变区蛋白抗体效价高，VP1蛋白少数区域的位点变异并不影响多克隆抗体的结合活性，可用作免疫检测诊断试剂。
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脊髓灰质炎病毒Sabin2株结构蛋白VP1在昆虫杆状病毒表达系统中的表达
目的 在昆虫杆状病毒表达系统中表达脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)Sabin2株结构蛋白VP1.方法 从Sabin2疫苗原液中RT-PCR扩增PV结构蛋白VP1基因.克隆入pFastBac1质粒,转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E coli DH 10Bac,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP1,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-VP1.将第2代rBac-VP1感染sf9细胞,间接免疫荧光法检测VP1蛋白的表达,并优化感染条件.结果 重组杆状病毒表达质粒.Bacmid-VP1转化子可扩增出3 203 bp的目的 片段;第2代rBac-VP1的滴度为6×107 pfu/ml,其感染的sf9细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,以不同MOI的rBac-VP1感染sf9细胞,VP1蛋白表达量差别不大,而在96 h内,随着感染时间的延长,VP1蛋白的表达量逐渐升高.结论 在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达了PV Sabin2株结构蛋白VP1,为脊髓灰质炎亚单位疫苗的研制奠定了基础.
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柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性
目的 原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group Atype 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性.方法 通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte( DE3),IPTG诱导表达.表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40 μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价.结果 重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确；表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15％；纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95％以上,可与猴CA16抗血清反应；不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系；各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1:8 .结论 已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 VP1蛋白 原核细胞 基因表达 免疫原性 -
埃可病毒6型表面特异性抗原VP1的原核表达及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达埃可病毒6型表面特异性蛋白VP1,并制备其多克隆抗体.方法 筛选VP1蛋白氨基酸序列中抗原性强的片段,优化基因序列,分别构建重组表达质粒pGEX-4T-2-vp1和pET-28a-vp1.将经双酶切及测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达,进行15％ SDS-PAGE鉴定.将融合蛋白VP1-GST及VP1-His分别用Glutathione resin和High Affinity Ni-NTA resin进行纯化.以纯化后的VP1-His融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,以VP1-GST融合蛋白为检测抗原,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性.结果 经双酶切及测序鉴定证明,重组质粒pGEX-4T-2-vp1和pET-28a-vp1构建正确.VP1-GST和VP1-His融合蛋白的相对分子质量分别为38 000和19 000,两种融合蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体形式表达,约占菌体总蛋白的60％和30％,纯化后的纯度均＞90％.兔抗VP1血清效价为1:320 000,可与融合蛋白VP1-GST和VP1-His发生特异性结合.结论 成功原核表达了融合蛋白VP1-His和VP1-GST,且VP1-His具有良好的免疫原性,其制备的多克隆抗体的特异性较好,为埃可病毒快速检测技术的建立奠定了基础.
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人细小病毒B19结构蛋白VP1的表达及IgM间接ELISA检测方法的初步建立
目的 原核表达并纯化人细小病毒B19(Human parvovirus B19,HPVB19)结构蛋白VP1,并初步建立IgM ELISA检测方法,用于B19病毒感染的检测.方法 采用PCR法从B19 IgM阳性血清中扩增VP1基因片段,亚克隆至表达载体pGEX-2T中,构建重组表达质粒pGEX-2T-VP1,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达.表达产物经疏水纯化后进行Western blot分析.以纯化的重组蛋白包被酶标板,建立IgM间接ELISA检测方法,确定Cut-off值,并进行初步应用.结果 重组原核表达质粒经双酶切鉴定构建正确；表达的重组融合蛋白相对分子质量为61000,主要以包涵体形式存在,纯度为96％,可与B19 IgG阳性血清发生特异性反应；建立的间接ELISA方法Cut-off值为0.102,灵敏度为91.7％,特异性为98.6％,与对照试剂检测结果的符合率为97.1％；用建立的方法检测4 500份健康献血者及39份类风湿性关节炎患者血清的B19 IgM抗体,阳性率分别为1.04％和10.3％.结论 原核表达并纯化了HPVB19 VP1蛋白,并初步建立了IgM间接ELISA检测方法,为B19病毒感染的早期诊断提供了参考.
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肠道病毒-D68 VP1蛋白原核表达、纯化及抗原性的评价
目的 原核表达EV-D68结构蛋白VP1,并对其抗原性进行评价.方法 以肠道病毒68型P1基因为模板,设计引物扩增出目的片段VP1,将其连接至大肠杆菌表达载体pGEX-5X-1上.将重组表达载体pGEX-5X-1-VP1转化大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)pLysS,对该工程菌进行诱导表达.菌体裂解后用SDS-PAGE电泳、Western-blot鉴定融合蛋白;对表达菌体进行超声破碎和亲和层析纯化;使用酶联免疫吸附试验方法评估目的蛋白与不同种属EV-D68阳性血清的结合能力及亲和力.结果 成功构建融合表达载体pGEX-5X-1-VP1,经过双酶切及测序鉴定均正确;成功表达和纯化出EV-D68(En-terovirus D68,EV-D68)VP1融合蛋白,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,得到与预期蛋白相对分子质量为61000大小一致的目的条带;纯化蛋白与不同种属的阳性血清可以特异性结合,与兔血清、恒河猴血清、小鼠血清的亲和力常数分别为1.6×106、3.9×105、3.1×106.结论 成功表达了EV-D68 VP1融合蛋白,为研究EV-D68 VP1蛋白的结构、功能及中和抗体筛选奠定基础.
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衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1对豚鼠结膜炎衣原体及E型沙眼衣原体的抑制作用
目的 探讨豚鼠结膜炎衣原体(GPIC)噬菌体衣壳蛋白Vp1对GPIC及E型沙眼衣原体的抑制作用,为沙眼衣原体感染的治疗提供新的思路.方法 用Vp1-pET30a(+)重组质粒菌表达Vp1蛋白,Western印迹法鉴定蛋白,透析袋纯化蛋白,BCA法测定蛋白浓度,将GPIC、E型沙眼衣原体分别与Vp1蛋白、Tris甘氨酸溶液、S蛋白及培养液室温孵育3h,衣原体培养过程中分别加入相同浓度的上述液体,72 h或48 h后,免疫荧光计数包涵体数.结果 GPIC在Vp1蛋白组、Tris甘氨酸溶液组、S蛋白组及培养液组培养72 h,包涵体计数分别为5.0±1.5、24± 1.2、25±1.7及25±1.5,各组包涵体数比较,差异有统计学意义(F=476.632,P＜ 0.05).Vp1蛋白组GPIC包涵体数显著低于Tris甘氨酸溶液组、S蛋白组及培养液组(P＜0.05),而后3组之间差异无统计学意义(P＞0.05).与阴性对照组(培养液组)相比,Vp1蛋白对GPIC的抑制率为(80.2±3.99)％.此外,Vp1蛋白对E型沙眼衣原体的抑制率为(77.2±1.79)％,t检验示Vp1对GPIC的作用与对E型沙眼衣原体的作用差异无统计学意义(f=2.057,P＞0.05).结论 Vp1蛋白可明显抑制GPIC的感染,同时对E型沙眼衣原体有相似的抑制作用.
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临床标本中沙眼衣原体噬菌体Vp1基因及血清Vp1抗体的检测
目的 检测临床标本中沙眼衣原体噬菌体Vp1基因及血清Vp1抗体.方法 收集天津性传播疾病研究所就诊患者的分泌物拭子和血清；用PCR法筛查分泌物标本中的Vp1基因；以Vp1蛋白作为抗原通过ELISA法及Western印迹法检测血清中针对Vp1抗体的存在；对PCR法结果阳性的分泌物进行细胞培养,然后免疫荧光法进行检测Vp1.结果 共筛查出36例拭子的PCR扩增产物在目的片段位置出现明显条带,及23例Vp1抗体阳性的血清.通过细胞培养及免疫荧光法,利用制备的单抗检测沙眼衣原体临床标本,尚未发现阳性标本.结论 从临床拭子及血清中成功筛查出沙眼衣原体噬菌体Vp1基因和Vp1抗体.
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衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1的克隆、表达和鉴定
目的 获得衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1基因及其蛋白.方法 提取噬菌体ΦCPG1及其核酸,并对Vp1克隆、表达,鉴定.结果 所获得的Vp1基因片段经测序,长度为1 661 bp,检索确认其序列与Genebank一致.对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹均显示获得相对分子质量约62 000的衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1.结论 成功获得了噬菌体衣壳蛋白Vp1,为进一步研究打下基础.
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沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白Vp1血清抗体的检测
衣原体噬菌体作为一种侵袭衣原体的病毒可使衣原体解体,具有抗感染的作用.目前已经发现6种衣原体噬菌体,其上的Vp1蛋白为衣原体噬菌体的衣壳蛋白.是主要的结构蛋白.该蛋白高度保守并可诱导机体产生抗体反应,适用于作为噬菌体的诊断抗原[1].沙眼衣原体是引起非淋球菌性尿道炎的主要病原体,其诊断困难、并发症严重.目前尚未在沙眼衣原体中发现噬菌体的存在.我们以豚鼠结膜炎衣原体(GPIC)噬菌体(PhiCPGI)的莺组Vp1纯化蛋白为抗原,通过ELISA法初步了解Ct感染者血清中针对Vp1蛋白的抗体,并用Western印迹法验证该抗体的特异性,推测Ct感染者血清中Vp1蛋白的存在,为沙眼衣原体与噬菌体的研究提供参考.
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肠道病毒71型VP1蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的:制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71) VP1外壳蛋白单克隆抗体.方法:利用重组纯化的EV71-VP1蛋白为抗原免疫BALB/c鼠,按常规杂交瘤技术进行细胞融合,对阳性杂交瘤细胞进行筛选及亚克隆,获得1株能稳定分泌抗EV71-VP1抗体的杂交瘤细胞株6F2B9,细胞体外扩大培养后的上清用Protein G柱纯化,超滤后用BCA法测其浓度,用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,间接ELISA方法检测其效价和特异性,间接免疫荧光法检测其与EV71病毒的特异性结合能力.结果:本研究得到的抗EV71-VP1抗体DSE-136,纯化后浓度为1.9 g/L,免疫球蛋白亚类为IgG2b,轻链属于K链；间接ELISA检测效价为1∶3.2×105;间接免疫荧光结果显示其可与EV71病毒特异性结合.结论:成功制备出1个效价高、特异性好的抗EV71-VP1单克隆抗体DSE-136,为VP1抗原诊断、疫苗研发及其效果评价奠定了基础.
