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霍乱毒素B亚单位在乳酸乳球菌食品级表达系统中的分泌性表达
目的 在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)食品级分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ和L.lactis MBP71/pSQ中克隆表达霍乱毒素B亚单位(CTB),实现CTB的分泌性表达.方法 采用PCR扩增霍乱弧菌569B菌株染色体中CTB蛋白编码基因片段,克隆到食品级分泌表达载体pSQZ和pSQ中,转化入宿主菌L.lactis MBP71,构建CTB的分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB;采用Western-blot检测重组菌株中CTB的表达及表达量.结果 PCR扩增得到CTB编码基因片段ctB,酶切、连接到载体pSQZ和pSQ并转化到宿主菌L.lactis MBP71中,构建了分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB.Western-blot检测发现,L.lactis MBP71/pSQ-ctB和L.lactis MBP71/pSQZ-ctB系统均能分泌性表达CTB,L.lactis MBP71/pSQ-ctB上清的表达量约为2 μg/ml;L.lactis MBP71/pSQ-ctB的表达效率远远高于L.lactis MBP71/pSQZ-ctB.结论 成功实现了CTB在食品级表达系统中的分泌性表达.
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乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达
目的 构建乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L lactis)食品级分泌表达载体,表达报告蛋白核酸内切酶(NucA).方法 PCR扩增乳酸乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)编码基因的启动子、核糖体结合位点、分泌信号和成熟肽前11个氨基酸编码序列,克隆到载体pSH91中,构建食品级分泌性表达载体pSQZ;克隆报告蛋白金黄色葡萄球菌NucA成熟肽的编码序列nucA到pSQZ中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MBP71,构建乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MBP71/pSQZ-nucA;采用TB-D法和酶谱法检测乳酸乳球菌分泌性表达的NucA活性.结果 PCR扩增得到usp45基因片段,酶切、连接到载体pSH91中构建了食品级表达载体pSQZ;将扩增的nucA基因片段克隆入载体pSQZ并转化乳酸乳球菌,得到乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MBP71/pSQZ-nucA.在TB-D平板上,L lactis MBP71/pSQZ- nucA克隆子周围出现橙色光晕;在酶谱检测中,L lactis MBP71/pSQZ-nucA上清和菌体在18 kDa位置均有橙色条带,但上清条带亮度和宽度大于菌体.结论 成功构建了乳酸乳球菌食品级分泌表达系统,实现了报告蛋白NucA在乳酸乳球菌中分泌性表达,为进一步保护性抗原的分泌性表达研究奠定了基础.
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乳酸乳球菌食品级载体的构建及Mn-SOD基因的克隆和表达
目的构建乳酸乳球菌(L. lactis)食品级载体,并利用其表达锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD).方法 PCR方法扩增L. lactis subsp.cremoris Wg2的隐性质粒pWV01的复制子、L. lactis MG1363的thyA基因及质粒pUC18的多克隆位点,PCR方法连接后构建食品级载体pSH91,CaCl2 法转化大肠杆菌X51菌株.提取质粒pSH91电转化L.lactis MBP71(△thyA),检测转化子在改良SA培养基上的生长能力.PCR扩增L. lactis MG1363菌株的sodA基因(含自身启动子),克隆到质粒pSH91中,构建食品级表达载体pSH91:SOD,电转化L. lactis MBP71,黄嘌呤氧化酶法测定转化子L. lactis MBP71/pSH91:SOD的SOD酶活性.结果经PCR扩增、连接、鉴定,食品级载体pSH91构建成功;转化L. lactis MBP71后,突变株回复了在改良SA培养基上生长能力,并且其生长速率和酸化能力与野生株相似.PCR扩增得到sodA基因并克隆入pSH91,构建了食品级表达载体pSH91:SOD.重组菌L. lactis MBP71/pSH91:SOD 的SOD酶活性较出发菌株L. lactis MBP71高10余倍.结论成功构建了食品级载体pSH91;利用该载体可在L. lactis中表达Mn-SOD等外源蛋白.
