霍乱毒素B亚单位在乳酸乳球菌食品级表达系统中的分泌性表达

目的 在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)食品级分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ和L.lactis MBP71/pSQ中克隆表达霍乱毒素B亚单位(CTB),实现CTB的分泌性表达.方法 采用PCR扩增霍乱弧菌569B菌株染色体中CTB蛋白编码基因片段,克隆到食品级分泌表达载体pSQZ和pSQ中,转化入宿主菌L.lactis MBP71,构建CTB的分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB;采用Western-blot检测重组菌株中CTB的表达及表达量.结果 PCR扩增得到CTB编码基因片段ctB,酶切、连接到载体pSQZ和pSQ并转化到宿主菌L.lactis MBP71中,构建了分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB.Western-blot检测发现,L.lactis MBP71/pSQ-ctB和L.lactis MBP71/pSQZ-ctB系统均能分泌性表达CTB,L.lactis MBP71/pSQ-ctB上清的表达量约为2 μg/ml;L.lactis MBP71/pSQ-ctB的表达效率远远高于L.lactis MBP71/pSQZ-ctB.结论 成功实现了CTB在食品级表达系统中的分泌性表达.

高产尿酸氧化酶乳酸工程菌的构建

目的 将尿酸氧化酶基因克隆到乳酸乳球菌(Llactis)NZ9000中,使之能启动nisA放大系统增加尿酸氧化酶活性,构建一株高效分解尿酸的基因工程菌.方法 根据GenBank上已知的产朊假丝酵母菌尿酸氧化酶基因序列(Uricase,E12709)设计引物,PCR扩增尿酸氧化酶基因片段,将其克隆入质粒PNZ8048、PMG36e,构建重组质粒PNZ8048-U、PMG36e-U,重组质粒电转化L.lactis NZ9000构建基因工程菌L.lactis NZ9000-PNZ8048-U、L.lactis NZ9000-PMG36e-U,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定重组菌体裂解液中的尿酸氧化酶,测定尿酸氧化酶的活性和在高尿酸患者血清中降解尿酸的能力.结果 构建的重组质粒PNZ8048-U、PMG36e-U经酶切和测序显示,尿酸氧化酶基因片段长度为0.9 kb,基因片段序列与GenBank上尿酸氧化酶基因序列完全一致.构建重组基因工二程菌L.lactis NZ9000-PNZ8048-U、L.lactis NZ9000-PMG36e-U,均表达相对分子质量约为34 000的重组蛋白,与从尿酸氧化酶基因序列推测的303个氨基酸的理论分子量相符.体外测定菌酶液活性,L.lactis NZ9000-PNZ8048-U组酶活性为(1.92±0.14)u/ml,产朊假丝酵母菌组酶活性为(0.55±0.05)u/ml,L.lactis NZ9000-PMG36e-U组酶活性为(0.29±0.06) u/ml.高尿酸血症患者血清培养结果显示加入生理盐水的对照组尿酸值(620.0±58.7) μmol/L,L.lactis NZ9000-PNZ8048-U组(321.0±46.2) μmol/L,L.lactis NZ9000-PMG36e-U组(568.0±47.3)μmol/L,产朊假丝酵母菌组(406.0±42.4)μmol/L,其他3组与对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 成功构建基因工程菌L.lactis NZ9000-PNZ8048-U,重组菌酶活性较基因来源菌产朊假丝酵母菌高,并可高效分解高尿酸患者血清中的尿酸.

弓形虫P30基因—乳酸乳球菌重组质粒的构建及其表达

目的 构建表达弓形虫昆山分离株P30基因的乳酸乳球菌表达载体L2-Ps-P30-T,并在乳酸乳球菌中表达P30蛋白.方法 用BamH Ⅰ/Xho Ⅰ将P30从质粒pSK-P30中切出并克隆至质粒pSK-PsT,构建pSK-Ps-P30-T质粒；用PvuⅡ将表达元件-Ps-P30-T-从pSK-Ps-P30-T质粒中切出,以相同的酶切位点导入大肠埃希菌与乳酸乳球菌穿梭质粒pTRKL2,构建L2-Ps-P30-T质粒；通过电转化将L2-Ps-P30-T导入乳酸乳球菌中,以Western blot鉴定P30蛋白的表达.结果 酶切及PCR鉴定质粒L2-Ps-P30-T构建正确,并在乳酸乳球菌中表达能被弓形虫病患者血清识别的分子质量单位为30 ku的蛋白.结论 重组载体L2-Ps-P30-T构建正确,电转化入乳酸乳球菌后能表达具有反应原性的P30蛋白.

人工合成苯丙氨酸脱氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达

目的将人工合成具有乳酸菌偏好密码子的苯丙氨酸脱氨酶基因(PALart),在乳酸乳球菌中克隆并进行食品级表达,以期进一步用于治疗苯丙酮尿症的研究.方法以欧芹苯丙氨酸脱氨酶氨基酸序列为准,人工合成以乳酸菌偏爱密码子编码相同氨基酸序列的基因PALart,将该基因克隆到食品级乳酸乳球菌高效表达系统pNZ8149/NZ3900中而获得基因工程菌,用HPLC法测定诱导表达出的苯丙氨酸脱氨酶活性.结果获得了能表达苯丙氨酸脱氨酶活性的阳性克隆pNZ8149-PALart/NZ3900.该酶的表达量与诱导物乳链菌肽的浓度有关.反应液pH值能明显影响工程菌转化苯丙氨酸为肉桂酸的转化率;以10 mmol/L的苯丙氨酸作为底物,在pH8.0的磷酸盐缓冲液中,于37℃反应18 h,其转化率可达64%.结论获得具有活性OALart食品级表达的乳酸乳球菌株,为进一步将其制成口服制剂用于治疗经典型苯丙酮尿症模型动物的实验研究打下基础.

幽门螺杆菌ureB在乳酸菌中的表达和抗原活性鉴定

在幽门螺杆菌疫苗研究中,尿素酶(Ure)是研究多、理想的疫苗候选抗原.目前研究常以减毒沙门菌作为活菌载体,但活的减毒沙门菌在人体及动物体内仍有一定的毒性,而不能用于体质弱的群体如婴幼儿、年老者及免疫缺陷者.以乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis,L. lactis)作为活菌疫苗载体,可以避免上述问题.L. lactis已经广泛用于食品工业,被公认为是安全的食品级微生物.作为异源蛋白和酶的输送载体,特别是L. lactis食品级高效表达系统的构建及应用己成为该领域研究的前沿和热点.

大肠杆菌htrA突变株构建及其在鼠疫拟菌颗粒疫苗制备中的应用

目的 基于乳酸乳球菌和鼠疫耶尔森菌F1抗原,制备鼠疫拟菌颗粒疫苗.方法 基于λ-Red一步重组技术,构建BL-21大肠杆菌htrA基因缺失突变株;将鼠疫菌F1抗原基因和PA基因克隆至pET-28 a(+)质粒中构建F1-PA融合蛋白表达载体,将此载体分别导入到BL-21大肠杆菌野生株和其htrA基因缺失突变株中构建F1-PA融合蛋白表达菌株;SDS-PAGE电泳分析F1-PA融合蛋白表达;镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白,梯度稀释透析法复性F1-PA融合蛋白;乳酸乳球菌经热酸处理制备拟菌颗粒;革兰染色和透射电镜分析拟菌颗粒的形态;拟菌颗粒分别与F1-PA融合蛋白或F1蛋白共孵育制备拟菌颗粒疫苗.结果 F1-PA融合蛋白在大肠杆菌野生株和htrA缺失突变株中均以包涵体形式表达.拟菌颗粒对F1-Pa融合蛋白的吸附能力明显高于对F1蛋白的吸附能力.F1-PA融合蛋白在大肠杆菌htrA突变株中的表达量明显高于在野生株中的表达量.结论 大肠杆菌htrA突变株用于表达F1-PA融合蛋白优于野生株.借助于肽聚糖锚钩蛋白,可将鼠疫菌F1抗原结合到乳酸乳球菌拟菌颗粒上制备鼠疫拟菌颗粒疫苗.

katE 基因在乳酸乳球菌中表达载体的构建

乳酸乳球菌(l.lactis ssp. lactis)是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，具有将不同的糖转化为 l-(+)-乳酸的发酵能力[1]。而乳酸乳球菌体内缺乏过氧化氢酶基因，无法顺利排出体内 H2o2，降低其毒副作用，因此会限制其生长。把过氧化氢酶 kate 基因构建表达载体后，导入乳酸乳球菌中令其表达，可以增加其抗氧化能力。

血红素加氧酶-1重组乳酸乳球菌灌胃对正常大鼠肠黏膜屏障的影响

目的 观察血红素加氧酶-1(HO-1)重组乳酸乳球菌同一剂量不同灌胃次数对正常大鼠肠黏膜屏障的影响.方法 将40只健康雄性SD大鼠随机分为:HO-1重组乳酸乳球菌灌胃一次组(HO1t组,n=8)、HO-1重组乳酸乳球菌灌胃二次组(HO2t组,n=8)、HO-1重组乳酸乳球菌灌胃三次组(HO3t组,n=8)、PBS溶液灌胃一次组(PBS1t组,n=8)和乳酸乳球菌灌胃一次组(LL1t组,n=8).各组灌胃剂量的容积均为1 ml,每次灌胃间隔24 h,在末次灌胃24 h后取回肠组织,检测肠组织Chiu's 6级评分、髓过氧化物酶(MPO)活性,同时从右心室抽取血液行细菌学检查.结果 各组肠黏膜Chiu's评分比较差异无统计学意义;与LL1t组比较,HO2t组和PBS1t组的肠组织内MPO活性较高,但比较没有统计学意义;HO2t组有1例、HO3t组有2例血培养阳性,其余各组血培养阴性.结论 HO-1重组乳酸乳球菌对正常大鼠灌胃,不会随着灌胃次数增加而影响肠黏膜屏障的功能.

乳酸乳球菌胞外多糖的制备及对环磷酰胺所致免疫损伤小鼠的保护作用

乳酸菌胞外多糖(lactic acid bacteria exopolysaccharide,LAB EPS)对免疫系统的调节作用已经受到广泛关注~([1]),中外一些学者对LABEPS的大量研究表明,EPS在防癌、抗癌和增强机体免疫力方面有着不可低估的作用~([2]).

血红素加氧酶-1重组乳酸乳球菌灌胃对失血性休克大鼠肠道炎症反应及细菌移位的影响

目的 利用基因工程原理合成携带血红素加氧酶-1(HO-1)基因的乳酸乳球菌,通过对正常大鼠灌胃后,观察其减轻失血性休克大鼠肠道炎症反应及肠黏膜屏障的保护效应.方法 按随机数字表法将30只健康清洁级雄性SD大鼠分为携带HO-1基因的乳酸乳球菌灌胃组(HO组,n=10)、乳酸乳球菌灌胃组(LL组,n=10)及磷酸盐缓冲液灌胃组(PBS组,n=10).实验前24 h灌胃,复制失血性休克模型.液体复苏1 h后取材,比较各组动物的死亡率、细菌移位以及肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性、HO-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)含量,并检查肠组织病理学变化.结果 与LL组和PBS组比较,HO组的死亡率、Chiu 6级评分、细菌移位发生率均明显降低(P均＜0.05);HO-1含量和IL-10灰度值均明显增加(P均＜0.05);与HO组和LL组比较,PBS组肠组织 MPO活性明显增加(P＜0.05).结论 携带HO-1基因的乳酸乳球菌对失血性休克大鼠有较好的肠黏膜屏障保护作用,能明显减轻肠道炎症反应和细菌移位的发生率.

血红素加氧酶-1重组乳酸乳球菌灌胃对失血性休克大鼠肠黏膜屏障的保护作用

目的 利用基因工程原理合成携带血红素加氧酶-1(HO-1)基因的乳酸乳球菌,通过对正常大鼠灌胃,观察其对失血性休克大鼠是否有肠黏膜屏障的保护效应,是否能够减少肠道炎症反应的发生.方法 将30只健康清洁级雄性SD大鼠随机分为携带HO-1基因的乳酸乳球菌灌胃组(HO组,n=10)、乳酸乳球菌灌胃组(LL组,n=10)及谷氨酸灌胃组(Glu组,n=10).Glu组在实验前6 h灌胃,其余两组在实验前24 h灌胃,复制失血性休克模型.液体复苏后1 h取材,比较各组动物的死亡率和平均动脉压(MAP);采用比色法检测肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性;用免疫组化法检测肠组织HO-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)的灰度值;并行肠组织病理学检查.结果 与LL组和Glu组比较,HO组死亡率明显降低(P均＜0.05);HO组液体复苏期(5、10、20和30 min)MAP均明显升高(P均＜0.05).与LL组比较,HO组和Glu组的IL-10和HO-1的灰度值均明显增加(P均＜0.05);与Glu组比较,HO组的HO1灰度值明显增加(P＜0.05).3组间TNF-α灰度值比较差异无显著性.LL组、Glu组和HO组肠组织Chiu's评分分别为(1.93±0.49)分、(1.75±0.58)分和(1.41±0.28)分,HO组与其他两组比较差异均有显著性(P均＜0.05).结论 携带HO-1基因的乳酸乳球菌灌胃可明显增强失血性休克大鼠HO-1活性,能较好地保护肠黏膜屏障,减轻肠道炎症反应.

幽门螺杆菌HspA乳酸菌疫苗构建及免疫反应性鉴定

目的 探讨幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A (HspA)在食品级乳酸乳球菌NZ3900菌株中的克隆表达及免疫反应性.方法 利用基因重组技术构建乳酸乳球菌重组子NZ3900/pNZ8110-hspA;绘制生长曲线,观察hspA插入对乳酸乳球菌重组子生长影响及乳酸链球菌素(Nisin)对重组子生长影响；采用钠十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测HspA在乳酸乳球菌中的表达；应用western-blot鉴定重组子表达HspA的免疫反应性.结果 成功扩增出幽门螺杆菌河南分离株(MEL-Hp27)的hspA基因,构建了hspA基因的乳酸乳球菌原核表达系统(NICE)；细菌生长曲线显示hspA的插入未对乳酸乳球菌重组子的生长产生影响,除10 ng/mL Nisin 对重组子生长影响较小外,20～100 ng/mL nisin对重组子的生长均有明显抑制；SDS-PAGE和Tricine SDS-PAGE 检测均未观察到HspA条带；western-blot鉴定结果显示乳酸乳球菌表达的HspA抗原蛋白具有良好免疫反应性.结论 HspA在乳酸乳球菌中的少量表达影响重组菌生长.

幽门螺杆菌热休克蛋白A在乳酸乳球菌中的表达及免疫学活性分析

目的 构建含幽门螺杆菌(H.pylori)热休克蛋白A编码基因的重组载体,并电转入乳酸乳球菌MG1363,表达目的 蛋白并分析其免疫原性,为H.pylori基因工程口服疫苗的研究和开发奠定基础.方法 以H.py-lori NCTC 11637株基因组DNA为模板,PCR扩增hspA基因,并克隆至乳酸乳球菌表达载体pMG36e中.将重组质粒转化E. coli DH5α,经鉴定的阳性重组质粒命名为pMG36e/hspA.以电穿孔法将pMG36e/hspA转化乳酸乳球菌MG1363并用Western blot检测HspA蛋白的表达.结果克隆重组后得到pMG36e/hspA.将pMG36e/hspA电转化MG1363后,收集菌体蛋白进行Western blot分析,在HspA的相对分子质量(Mr≈13 kDa)处出现特异性条带.结论 首次成功构建了表达 H.pylori HspA的重组乳酸乳球菌MG1363,为进一步口服疫苗的相关研究奠定了基础.

产类细菌素乳酸乳球菌V528的紫外线诱变育种研究

目的 获取高产抑制鸡白痢沙门菌生长的类细菌素乳酸乳球菌的突变菌株.方法 在紫外线照射致死率为82.7%的剂量下,对处于对数生长后期的乳酸乳球菌V528进行紫外线二次复合诱变处理.分别随机对第一次和第二次复合处理后生长的117株和310株菌进行效价测定分析.结果 在实验所用的照射剂量下,抑菌效价提高的正突变菌株占有一定优势,负突变菌株较少,其中突变菌株Lact.174的抑菌效价较V528的效价提高了8.48倍,并具有一定的遗传稳定性.结论 运用紫外诱变育种技术可有效地获得高产类细菌素的突变菌株.

变形链球菌致龋抗原基因在乳酸乳球菌的表达

目的 克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(GbpB)功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中表达.方法 在实验中利用了分子克隆技术构建携带GbpB基因的重组原核表达质粒pNI1,将重组质粒转化乳酸乳球菌YF02株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的GbpB蛋白用SDS-PAGE进行鉴定.结果 成功克隆了GbpB功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中得到其融合蛋白的表达.结论 利用分子生物学技术能够成功克隆GbpB功能区基因并获得乳酸乳球菌融合蛋白的表达,为后续研究奠定了基础.

猪圆环病毒2型ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒ORF5嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中的表达

目的 乳酸乳球菌中表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5的嵌合抗原表位.方法 按乳酸乳球菌密码子使用偏好设计并合成PCV2ORF2及PRRSV ORF5的串联抗原表位基因,插入至乳酸菌表达质粒pNZ8148,构建重组表达质粒,转化乳酸乳球菌NZ9000中,经乳酸菌素(nisin)诱导表达嵌合蛋白,采用Ni-NTA亲和层析纯化,进行12％SDS-PAGE分析.结果 重组表达质粒经双酶切鉴定,构建正确.嵌合蛋白相对分子质量约25 000,在乳酸乳球菌中主要以可溶性形式表达,纯化后纯度达96％以上,浓度约1 mg/mL,产量可达60 mg/L细菌培养物.结论 PCV2ORF2与PRRSV ORF5的嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中得到高效可溶性表达.

大鼠Endostatin在乳酸乳球菌中的克隆与表达

目的在乳酸乳球菌中克隆与表达大鼠endostatin.方法采用RNA分离试剂盒从大鼠肾脏组织中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增其endostatin基因,将该基因克隆进pUC19质粒中,转化大肠杆菌DH5a,提取质粒,分离基因,酶切后与含有乳酸乳球菌启动子nisin的pLA141质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的GM17培养基上培养.用nisin诱导endostatin表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果表达产物相对分子质量约为14 000,表达量约为10mg/L.结论在乳酸乳球菌中可以表达出正确的大鼠endostatin重组蛋白,为下一步进行重组蛋白的活性检测以及临床实验提供了依据.

043 乳酸乳球菌分泌的IL-10治疗鼠结肠炎

从脑脓肿患者脓肿液中分离出乳酸乳球菌乳脂亚种1例

2003年5月,我们从1例诊断为左颞顶叶脑脓肿患者的脓肿液中,2次分离出乳酸乳球菌乳脂亚种菌(Lactococcus lactis subsp.cremoris)报道如下.

表达弓形虫棒状体蛋白1的重组乳酸乳球菌诱导小鼠免疫应答的研究

目的 用表达弓形虫棒状体蛋白1(ROP1)的乳酸乳球菌口服免疫小鼠,观察其所诱导的体液免疫、黏膜体液免疫和保护力.方法 69只BALB/c小鼠随机分成疫苗免疫组、乳球菌对照组和生理盐水组,每次分别饲喂5×109个/鼠悬浮在缓冲液中的重组乳酸乳球菌、不含重组质粒的乳酸乳球菌及等体积的生理盐水.第27、34、48天分别从鼠尾静脉采血,分离血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IgG水平;第48天杀死3只小鼠,分离小肠黏液检测SIgA水平;第48天用弓形虫灌胃感染小鼠,观察小鼠发病情况,计算小鼠死亡率,30 d后统计小鼠肝、脑组织中的虫体数量.结果 疫苗免疫组小鼠IgG水平与乳球菌对照组、生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P均＜0.01).疫苗免疫组小鼠SIgA水平与乳球菌对照组、生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P均＜0.01).疫苗免疫组小鼠肝、脑组织中虫体数与乳球菌对照组、生理盐水组比较,差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 表达弓形虫ROP1蛋白的乳酸乳球菌可诱导小鼠体液免疫和黏膜体液免疫,但对弓形虫感染无保护力.