改善沙门菌载体疫苗效能的若干策略

沙门菌是一种侵袭性胞内菌,利用其侵袭性,可将其减毒后改造为疫苗载体,携带异源抗原基因到细胞内,表达相应的异源抗原,从而引发免疫保护反应.然而成功研制沙门菌载体疫苗必需解决一些关键问题,包括:选择合适的保护性异源抗原和表达载体,确定抗原在载体内的表达方式(即体细胞内膜结合型或分泌型表达)和宿主细胞内的定位(内体或细胞质)等.针对上述问题,从筛选适当的沙门菌载体菌株、确定优启动子、增强质粒稳定性、抗原表达后准确定位、提高抗原的免疫原性和优化疫苗接种制度六个方面,讨论近年来改善减毒沙门菌载体疫苗的研究策略.

携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门菌促血管形成的实验研究

目的：探讨携带肝细胞生长因子（HGF）基因的减毒沙门菌体外促血管形成的效应。方法构建携带 HGF基因真核表达载体的减毒沙门菌菌株（TPH），体外转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后观察目的基因表达及其增殖活性；评价 TPH的细胞表达上清对鸡胚绒膜尿囊膜血管生成效应的刺激效应。结果构建的 TPH菌株在体外可有效转染 HUVEC并表达有活性的 HGF蛋白，6×105个 HUVEC细胞可表达160~190 ng的 HGF蛋白，和对照组相比，TPH转染组细胞表达上清可明显促进 HUVEC增殖，而且具有剂量-效应关系；TPH 转染组细胞表达上清也刺激鸡胚绒膜尿囊膜小血管生成，其血管数量（133.0±11.5）/cm2明显大于转染 TP的 HUVEC细胞上清组（83.3±5.5）/cm2和对照组（62.7±7.1）/cm2（P<0.05）。结论携带 HGF基因的减毒沙门菌可有效转染 HUVEC并促进细胞增殖，刺激小血管新生，可能在组织创面愈合中起重要作用，在胃溃疡治疗中有潜在的应用价值。

表达HPV6b L1-E7嵌合蛋白的减毒沙门菌诱导小鼠免疫应答

目的探讨表达人乳头状瘤病毒6b型(HPV6b)L1-E7嵌合蛋白的减毒沙门菌诱导小鼠粘膜及系统免疫反应的可行性. 方法对重组减毒沙门菌S.BRD509/pTETnir15-6bL1E7体外厌氧诱导其表达,Western blot方法鉴定表达的 L1-E7蛋白.此重组沙门菌经滴鼻和口服联合粘膜免疫BALB/c小鼠,采用ELISA方法及足垫肿胀试验分别检测免疫小鼠血清及阴道冲洗液中特异性抗体和DTH反应. 结果 Western blot分析显示,重组沙门菌在预计相对分子质量(Mr)56×103处有特异染色带,提示此重组沙门菌能表达特异的HPV6bL1-E7蛋白.ELISA检测结果表明实验组小鼠阴道冲洗液中HPV6b L1特异性sIgA显著升高,和对照组比较两者差异有显著性(P＜0.01),但小鼠血清中HPV6b L1 IgG抗体无明显变化,实验组和对照组两者差异无显著性.DTH 结果显示:与对照组比较,实验组小鼠接受HPV6b L1-E7抗原刺激后产生明显阳性反应,提示重组沙门菌免疫小鼠产生了针对HPV6b L1-E7抗原的特异性细胞免疫反应. 结论构建的重组减毒沙门菌S.BRD509/pTETnir15-6bL1E7可激发有效的粘膜免疫及细胞免疫反应,为进一步研制新型HPV粘膜疫苗奠定了实验基础.

鸡IL-2、IL-1 8、IFN-γ cDNA和CpG DNA在减毒沙门菌运送H5亚型禽流感DNA疫苗中的佐剂作用

目的 探讨鸡IL-2、IL-18、IFN-γ cDNA和CpG DNA在减毒沙门菌运送H5亚型禽流感DNA疫苗中的佐剂作用.方法 将携带禽流感病毒(AIV)DNA疫苗的重组沙门菌SL7207(pVAX1-HA-IL2)、SL7207(pVAX1-HA-IL18)、SL7207(pVAX1-HA-IFN-γ)、SL7207(pVAX1-HA-CpG)、SL7207(pVAX1-HA)和SL7207(pVAX1)经口服和滴鼻途径首免1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,测定免疫鸡的体液和黏膜免疫应答水平,并进行攻毒保护试验.结果 二免后3周,SL7207(pVAX1-HA-CpG)、SL7207(pVAX1-HA-IFN-γ)免疫组以及SL7207(pVAX1-HA)和SL7207(pVAX1-IFN-γ)联合免疫组鸡产生了较高水平的特异性黏膜免疫应答(P＜0.05),但重组菌免疫鸡血清中抗AIV HI抗体水平与空载体组相比差异无统计学意义.SL7207(pVAX1-HA-CpG)、SL7207(pVAX1-HA-IFN-γ)的免疫保护指数显著高于阴性对照组.结论 初步观察佐剂效应依次为:CpG＞IFN-γ＞IL-18,IL-2未表现出佐剂效应.

幽门螺杆菌ureB在乳酸菌中的表达和抗原活性鉴定

在幽门螺杆菌疫苗研究中,尿素酶(Ure)是研究多、理想的疫苗候选抗原.目前研究常以减毒沙门菌作为活菌载体,但活的减毒沙门菌在人体及动物体内仍有一定的毒性,而不能用于体质弱的群体如婴幼儿、年老者及免疫缺陷者.以乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis,L. lactis)作为活菌疫苗载体,可以避免上述问题.L. lactis已经广泛用于食品工业,被公认为是安全的食品级微生物.作为异源蛋白和酶的输送载体,特别是L. lactis食品级高效表达系统的构建及应用己成为该领域研究的前沿和热点.

口服携带人IL-12、GM-CSF基因的减毒沙门菌抗肿瘤作用的试验

目的探讨以减毒沙门菌作为口服基因治疗载体的可行性. 方法通过电转化法将真核表达载体pCMVhIL-12、pCMVhGM-CSF、EGFPN1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261中,经由胃管喂给BALB/c和C57BL/6小鼠.6周后分别用4T1乳腺癌细胞和Lewis肺癌细胞进行攻击.通过流式细胞仪、共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在小鼠各组织中的表达,通过PCR和ELISA法检测IL-12、GM-CSF基因的整合和表达情况.并考察肿瘤的受抑情况和小鼠的生存期. 结果在小鼠的肝、脾、小肠、肾脏和肿瘤中可检测到绿色荧光蛋白的表达和相应细胞因子基因的整合.血清中相应的细胞因子水平较对照组明显升高(P<0.05),生存期远远超过对照组小鼠(P<0.05). 结论减毒沙门菌可作为口服基因治疗载体,可能为肿瘤的治疗提供一条简便、安全、有效的途径.

减毒沙门菌为载体的PspA优势抗原组合DNA疫苗对肺炎链球菌定植的防御作用评价

目的 评价以减毒沙门菌为载体携带PspA不同家族亚类优势抗原的肺炎链球菌DNA疫苗对不同侵袭性肺炎链球菌定植的防御作用,探讨优化肺炎链球菌DNA疫苗增强鼻咽部黏膜免疫的策略.方法 应用分子克隆技术,在前期研究基础上,制备携带PspA不同家族亚类优势抗原(PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3)的减毒沙门菌为宿主菌的非抗性基因筛选的真核质粒-宿主致死平衡系统,应用RT-PCR和免疫印迹技术检测优势抗原的表达情况,并在含或不含DAP的SOB培养基中传代培养,抽提质粒PCR检测疫苗携带抗原的稳定性.以PBS为对照,口服免疫接种BABL/c小鼠,ELISA检测鼻咽部sIgA的水平；应用小鼠鼻咽部定植模型检测疫苗对不同侵袭性肺炎链球菌定植的防御作用.结果 成功构建出携带PspA不同家族亚类优势抗原(PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3)的减毒沙门菌为宿主菌的非抗性基因筛选的真核质粒-宿主致死平衡系统,且稳定性好；免疫小鼠鼻咽部抗PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3的特异性sIgA的水平显著高于对照组(P＜0.01)；免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌定植模型的菌落计数较对照组明显减少(P＜0.01).结论 以减毒沙门菌为载体携带PspA不同家族亚类优势抗原是增强肺炎链球菌DNA疫苗鼻咽部黏膜免疫的优化策略.

减毒沙门菌介导基因对舌癌生长抑制作用的动物实验

本实验利用减毒沙门菌的肿瘤靶向性,以其为载体,携带抑癌基因Tip30和人IFN-γ基因,通过口服方式对舌癌进行基因治疗动物实验,以期在临床上为舌癌的基因治疗提供动物实验依据.

减毒沙门菌载体在应激性溃疡基因治疗中的研究现状

近年来基因疗法发展迅速，减毒沙门菌介导的真核表达载体防治应激性溃疡的基因治疗方法已经逐步从实验及基础研究过渡到临床试用阶段，理论和技术层次上日趋成熟。而基于低氧诱导因子1α与角质细胞生长因子防治应激性溃疡的研究现状一直缺乏整理与总结，该文整理了携带双基因的重组减毒沙门菌的实现情况及存在问题，为进一步研究提供帮助。

低氧诱导因子-1α和角质细胞生长因子双基因重组减毒沙门菌菌株的构建及其在肠上皮细胞中的表达

目的 构建同时携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和角质细胞生长因子(KGF)真核表达载体的减毒沙门菌菌株(Ty21a-pIRES-HIF-IRES-KGF,TPHK),观察其在防治肠黏膜损伤方面潜在的应用前景.方法 采用RT-PCR法从低氧处理A549细胞扩增HIF-1α cDNA后连接到载体pIRES-SEQ的NheI和MluI酶切位点,构建单基因重组质粒pIRES-HIF.然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板扩增KGF基因并克隆到重组质粒pIRES-HIF的XbaI 和NotI酶切位点上,获得双基因重组质粒pIRES-HIF-IRES-KGF.采用电穿孔法将pIRES-HIF-IRES-KGF质粒转入减毒沙门菌Ty21a中,通过筛选获得TPHK.该菌株转染肠上皮细胞IEC-6后48 h,用ELISA法检测上清中HIF1α和KGF的表达水平.并采用MTT方法分析不同剂量表达产物对IEC-6细胞的作用.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实TPHK构建成功.TPHK转染正常肠上皮细胞IEC-6后,48 h取上清用ELISA法检测HIF和KGF的表达,结果表明6×105个细胞可表达(16.03±1.47)ng的HIF蛋白和(17.77±1.83)ng的KGF蛋白.MTT结果表明表达上清有明显刺激正常肠上皮细胞IEC-6增殖的活性(P＜0.05),加入20%表达上清时刺激活性达高峰.结论 成功构建了TPHK,其可有效转染肠上皮细胞IEC-6,表达上清可显著促进IEC-6细胞增殖.提示TPHK具有潜在的在肠黏膜损伤局部应用的前景.

构建携带幽门螺杆菌oipA核酸的减毒沙门重组菌株及其免疫保护作用的初步研究

目的:优化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)oipA核酸疫苗,构建含oipA核酸的SL7207(减毒伤寒沙门氏菌)重组菌株,并研究其在防御H.pylori感染中的作用.方法:对oipA基因进行密码子优化,Kozak前导序列添加、CpG序列优化,将oipA优化前后的基因分别克隆入pVAX1真核表达载体,获得pVAX1-oipA和pVAX1-optioipA重组子,将上述重组子与空载体pVAX1瞬时转染AGS细胞,应用Western blot检测转染细胞中OipA蛋白的表达.将重组子转化LB5000进行甲基化修饰,利用修饰后重组子转化终宿主菌SL7207,提取SL7207/pVAX1-oipA,SL7207/pVAX1-optioipA菌株质粒进行PCR,酶切鉴定.用SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA免疫C57BL/6小鼠,末次免疫2周后检测抗OipA抗体,并在末次免疫4周后予H.pylori SS1(5 × 10~8CFU/只)攻击,攻击3次,隔天一次,攻击4周后处死动物,取胃组织做快速尿素酶实验和H.pylori定量培养以检测H.pylori感染状况.结果:pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA均可在AGS细胞中表达,且pVAX1-optioipA的OiDA蛋白表达量高于pVAX1-oipA;从SL7207/pVAX1-oipA和SL7207/pVAX1-optioipA抽提的质粒,经PCR,酶切鉴定正确;免疫小鼠血清中产生抗OipA蛋白的特异性抗体IgG,且pVAX1-optioipA疫苗组诱导IgG水平明显高于pVAX1-oipA疫苗组(P＜0.01);pVAX1-oipA、pVAX1-optioipA疫苗组H.pylori感染率分别为60%(9/15)、26.67%(4/15),明显低于对照组100%(10/10)(P＜0.01).结论:成功构建携带pVAX1-oipA,pVAX1-optioipA的SL7207重组菌株,并验证其对C57BL/6小鼠H.pylori感染具有免疫预防作用,且优化oipn基因有助于提高免疫保护效果.

携带低氧诱导因子-1α及角质细胞生长因子的减毒沙门菌TPHK的构建及其在低氧应激大鼠胃肠组织中的表达

目的 构建携带低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)的减毒沙门菌TPHK,并检测其在低氧应激大鼠胃肠组织中的表达.方法 从质粒pIRES-KGF中PCR扩增获得KGF基因片段,经双酶切回收后,与pIRES-HIF质粒进行连接,获得双基因重组质粒pIRES-HIF-KGF,CaCl2法转化减毒沙门菌Ty21a,获得重组菌株TPHK.将TPHK菌液灌胃给予大鼠,109 cfu/(只·d),饲养7d后,置模拟海拔6 000 m的高原低氧舱,舱内连续饲养7d,采集大鼠胃及小肠组织,ELISA法检测HIF-1α及KGF的表达水平.结果 重组质粒pIRES-HIF-KGF及重组菌株TPHK经双酶切及测序鉴定证明构建正确.给予TPHK菌液后可明显提高低氧应激大鼠胃及肠组织中HIF-1α及KGF的表达水平(P＜0.001).结论 成功构建了携带HIF-1α及KGF的减毒沙门菌TPHK,且其可提高HIF-1α及KGF在低氧应激大鼠胃肠组织中的表达.

携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门菌工程菌株的构建及其活性

目的 构建携带肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)基因的减毒沙门菌工程菌株,并检测其体外活性.方法 从人胎盘cDNA文库中PCR扩增人HGF基因,克隆至真核表达载体pcK上,构建重组表达质粒pcKH,电穿孔法转入减毒沙门菌Ty21a中,获得携带HGF基因的减毒沙门菌工程菌株.将该菌株转染胃黏膜上皮细胞GES-1,48 h后采用ELISA方法检测上清中HGF蛋白的表达水平,MTT法检测不同浓度HGF表达产物对GES-1细胞增殖活力的影响.结果 克隆的人HGF基因序列与GenBank中登录的人HGF cDNA序列(M60718.1)完全一致；重组表达质粒pcKH经双酶切鉴定构建正确；成功构建了携带HGF基因的减毒沙门菌工程菌株,可有效转染GES-1细胞,并表达活性HGF蛋白(14～16 ng/6×105个细胞),其可显著刺激GES -1细胞增殖(P＜0.05).结论 已成功构建携带HGF基因的减毒沙门菌工程菌株,其可能具有在体内治疗胃肠疾病的潜能.

携带颗粒溶素活性肽基因的减毒沙门菌对小鼠黑色素瘤的治疗作用

目的 观察携带颗粒溶素( Granulysin,GLS)活性肽基因的减毒沙门菌对小鼠黑色素瘤的治疗作用.方法 将小鼠黑色素瘤细胞株B16接种C57 BL/6J小鼠,复制小鼠黑色素瘤模型.将pBudCE4.1-S9K重组沙门菌以不同剂量及不同时间接种于小鼠肿瘤内,检测肿瘤体积,确定佳治疗剂量和起始时间.将模型小鼠随机分为PBS组、减毒沙门菌组、pBudCE4.1重组沙门菌组和pBudCE4.1-S9K重组沙门菌组,分别采用佳治疗剂量,在佳治疗起始时间开始治疗,每周1次,共3次.从成瘤开始,每2d测量肿瘤的长径(L)和短径(S),计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,并观察小鼠的荷瘤存活期.结果 小鼠黑色素瘤模型复制成功.重组沙门菌的佳治疗剂量和起始时间分别为107个/ml和第4天.与PBS组、减毒沙门菌组和pBudCE4.1重组沙门菌组相比,pBudCE4.1-S9K重组沙门菌组能明显抑制模型小鼠肿瘤的生长,使肿瘤体积增长延缓,并明显延长荷瘤小鼠的存活期.结论 pBudCE4.1-S9K重组减毒沙门菌对小鼠黑色素瘤具有一定的治疗作用.

010 以减毒沙门菌将重组细胞因子导向免疫系统的新免疫疗法

phoP/phoQ激活的启动子应用于以减毒沙门菌为载体的疫苗系统

phoP/phoQ为沙门菌的双成分调节子,phoQ可感受巨噬细胞中一些因子的改变,显示组氨酸激酶活性,使phoP氨基端特定的残基磷酸化,磷酸化后的phoP结合于特定的启动子,诱导或抑制一系列基因的表达.受phoP/phoQ激活的pagC基因的启动子ppagC能有效地驱动外源基因在鼠伤寒杆菌中的表达,激发宿主抗该外源蛋白的抗体.使用ppagC可克服在减毒沙门菌中因外源基因的组成性表达而带来的低表达和表达质粒不稳定的问题.因此,ppagC在以减毒沙门菌为载体的疫苗研制中具有很好的应用前景.

优化密码对牛乳头瘤病毒L1基因粘膜免疫的增强作用

为探讨优化密码对牛乳头瘤病毒1型主要晚期基因(BPV1L1)免疫原性的影响,分别将含野生型和优化密码的人源化BPV1L1基因的真核表达质粒转入减毒沙门菌S.BRD509后,通过滴鼻、阴道免疫、静脉注射、腹腔注射等途径免疫小鼠,经VLP ELISA方法测定抗L1构象性抗体产生,MTT法观察诱导的特异性细胞免疫反应.抗体检测结果显示,经粘膜免疫途径,与含有野生型L1基因的表达质粒pcDNA3WBPVL1相比,含优化密码L1基因的pcDNA3HBPVL1诱导产生的SIgA、IgG明显升高,而细胞免疫反应无明显差异.表明优化密码能促进乳头瘤病毒晚期基因L1诱导的体液免疫反应,减毒沙门菌是PVL1 DNA疫苗粘膜免疫的有效载体.

重组减毒沙门菌粘膜免疫的研究进展

文章介绍以减毒沙门菌为载体进行粘膜免疫的机制,讨论沙门菌的不同减毒类型,所用的启动子,可呈递的抗原,免疫的途径以及免疫效果的检测和存在的问题.

肝细胞生长因子基因治疗大鼠实验性结肠炎的研究

溃疡性结肠炎(UC)原因不明,病变主要位于结肠黏膜层.肝细胞生长因子(HGF)是一种多功能的细胞因子,可促进血管内皮细胞增殖和血管形成、促进细胞再生、抑制细胞凋亡、调节免疫、减轻炎性反应,促进创伤愈合[1].本研究将HGF基因的真核表达载体转入减毒沙门菌中以制备基因治疗药物,灌肠注人大鼠体内,探讨HGF基因治疗结肠溃疡的作用,探索UC的治疗方法.

口服型VEGFR-2 DNA疫苗的研制及其对小鼠的免疫效应

目的:血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial factor recepto-2,VEGFR-2)在肿瘤生长和转移过程中起着重要作用,制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗并研究其生物免疫效应.方法:采用基因重组技术构建VEGFR-2胞外区基因表达载体pcDNA3.1-VR-2, DNA序列分析证实后,脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其VEGFR蛋白表达;以氯化钙法将pcDNA3.1-VR-2转化减毒沙门菌SL3261,制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗.口服型疫苗免疫C57BL/6小鼠,ELISA法检测免疫后小鼠外周血VEGFR-2抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞对小鼠血管内皮细胞的体外杀伤活性.结果:成功制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗.ELISA法检测显示,疫苗组小鼠抗体滴度随着免疫时间和免疫次数的增加而增高,在免疫6周后产生了高水平抗VEGFR-2 IgG类抗体(1.07±0.018),明显高于生理盐水组(0.14±0.033)和质粒对照组(0.14±0.038),差异均有统计学意义(F=853.17,P=0.000).MTT法检测显示,疫苗组小鼠脾淋巴细胞对靶细胞MS1的杀伤率随着效靶比的增加而增加,在效靶比8∶1时CTL活性(89.38±1.51)明显高于生理盐水组(15.17±2.54)和空质粒对照组(12.99±4.31),差异有统计学意义(F=315.42,P=0.000).结论:成功制备了口服型VEGFR-2 DNA疫苗,该疫苗可激活小鼠特异性的细胞免疫和体液免疫,为进一步抗肿瘤研究奠定了基础.