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口服携带人IL-12、GM-CSF基因的减毒沙门菌抗肿瘤作用的试验
目的探讨以减毒沙门菌作为口服基因治疗载体的可行性. 方法通过电转化法将真核表达载体pCMVhIL-12、pCMVhGM-CSF、EGFPN1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261中,经由胃管喂给BALB/c和C57BL/6小鼠.6周后分别用4T1乳腺癌细胞和Lewis肺癌细胞进行攻击.通过流式细胞仪、共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在小鼠各组织中的表达,通过PCR和ELISA法检测IL-12、GM-CSF基因的整合和表达情况.并考察肿瘤的受抑情况和小鼠的生存期. 结果在小鼠的肝、脾、小肠、肾脏和肿瘤中可检测到绿色荧光蛋白的表达和相应细胞因子基因的整合.血清中相应的细胞因子水平较对照组明显升高(P<0.05),生存期远远超过对照组小鼠(P<0.05). 结论减毒沙门菌可作为口服基因治疗载体,可能为肿瘤的治疗提供一条简便、安全、有效的途径.
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GM-SCF与LMP2A融合基因GC2A重组腺病毒载体的构建与鉴定
目的:构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因与EB病毒基因LMP2A融合基因GC2A的重组腺病毒表达载体.方法:将构建的融合基因GC2A定向亚克隆至质粒pAdTrack-CMV上,经酶切及电泳检测后,PmeL酶切pAdTrack-CMV-GC2A,与质粒pAdEasy-1一起电转化E.coli.BJ5183,筛选重组菌,经Pac Ⅰ酶切鉴定后用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组腺病毒vAd-GC2A,采用pAdTrack-CMV-GC2A中报告基因GFP的表达,观测其表达情况.结果:采用内切酶Bg1Ⅱ和EcoR Ⅴ对质粒pAdTrack-CMV-GC2A进行双酶切分析,电泳后可观察到约1 961和9 200 bp的片段.重组腺病毒载体经Pac Ⅰ酶切后观察到约33 kb的DNA片段和4.5 kb的DNA片段,说明pAdTrack-CMV-GC2A和pAdEasy-1的重组发生在ori和右臂区,pAd-GC2A经Pac Ⅰ酶切线性化后,磷酸钙法转染293细胞,56 h后在荧光倒置显微镜下可看到有绿色荧光出现,说明已转染成功,并能在293细胞中表达.结论:融合基因GC2A正确插入,真核表达栽体vAd-GC2A成功构建,在293细胞中包装获得重组腺病毒.
关键词： 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 融合基因GC2A 基因重组 腺病毒载体 -
新型溶瘤病毒oHSV2hGM-CSF的构建及其抗肿瘤作用
目的 构建表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的2型溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV2hGM-CSF),初步验证其体外溶瘤效果及其对小鼠B16R黑色素瘤模型的体内疗效.方法 采用PCR、分子克隆及同源重组技术,从HG52野生病毒株的基因组中剔除ICP34.5和ICP47基因,并插入hGM-CSF表达序列,构建oHSV2hGM-CSF.将HeLa、Eca-109和PG等16种肿瘤细胞分别接种到24孔板,用1型溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV1 hGM-CSF)或oHSV2hGM-CSF(感染复数=1)感染24、48 h后,显微镜下观察细胞病变.以表达HSV感染受体的C57 BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16R为动物模型,当肿瘤生长至7～8 mm3时,瘤内分别注射2.3×106 PFU的oHSV1hGM-GSF和oHSV2hGM-CSF,共3次,每次间隔3d,同时测量肿瘤大小,并观察生存期.结果 PCR检测和DNA序列分析结果证实,各目的基因已被剔除,hGM-CSF表达盒插入到ICP34.5的基因位点.oHSV1hGM-CSF和oHSV2hGM-CSF感染肿瘤细胞24h后,即能观察到细胞病变,目溶瘤谱较广,oHSV2hGM-CSF感染的肿瘤细胞合胞体现象多于oHSV1hGM-CSF感染者；感染48 h后,oHSV2hGM-CSF对HeLa、HepG2、SK-Mel-28、B16R、U87-MG细胞的溶瘤效果优于oHSV1hGM-CSF.动物实验显示,肿瘤接种后第15天,PBS组、oHSV1 hGM-CSF治疗组和oHSV2hGM-CSF治疗组小鼠的肿瘤体积分别为( 374.7±128.24) mm3、( 128.23±45.32) mm3和( 10.06±5.10) mm3,oHSV2hGM-CSF明显延缓了荷瘤小鼠肿瘤的生长.PBS组小鼠在接种B16R细胞22 d后全部死亡；oHSV1 hGM-CSF治疗组和oHSV2hGM-CSF治疗组小鼠在接种B16R细胞110 d时,存活率分别为60％和80％(P＞0.05).与PBS组相比,oHSV1 hGM-CSF治疗组和oHSV2hGM-CSF治疗组小鼠的生存期明显延长(P＜0.01).结论 oHSV2hGM-C-SF对人肿瘤细胞溶瘤谱较广,对荷B16R黑色素瘤瘤内注射有较好的抗肿瘤效应,具有较好的开发前景.
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人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合R-CHOP方案治疗弥漫大B细胞淋巴瘤的临床疗效研究
目的：探讨人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（ rhGM-CSF）联合R-CHOP方案治疗弥漫大B细胞淋巴瘤的临床疗效。方法选取2014年1月至2015年1月住院治疗的弥漫大B细胞淋巴瘤（ DLBCL）患者72例，采用数字表法将患者随机分为利妥昔单抗联合CHOP组（ R-CHOP组，36例）和联合组（36例）， R-CHOP组采用R-CHOP方案治疗，联合组在R-CHOP的基础上加用rhGM-CSF治疗。在化疗前、化疗开始后第15天，化疗后1、3个月采集两组患者外周血，分离单核细胞，使用流式细胞仪计数HLA-DR、CD197标记的M1和CD68、CDl63标记的M2，于化疗后4个月对患者进行疗效评价，记录不良反应情况。结果两组治疗后4个月，联合组客观有效率（ORR，91．67％）显著高于R-CHOP组（ORR，75．00％），两组差异有统计学意义（χ2＝4．372，P＜0．05）；联合组治疗后不良反应中，肝功能损伤Ⅰ～Ⅱ级8．33％，Ⅲ～Ⅳ级0．00％；白细胞降低Ⅰ～Ⅱ级25．00％，Ⅲ～Ⅳ级5．56％；血小板减少Ⅰ～Ⅱ级19.44％，Ⅲ～Ⅳ级8．33％；恶心呕吐Ⅰ～Ⅱ级8．33％，Ⅲ～Ⅳ级0．00％。 R-CHOP组治疗后不良反应中，肝功能损伤Ⅰ～Ⅱ级13．89％，Ⅲ～Ⅳ级2．78％；白细胞降低Ⅰ～Ⅱ级36．11％，Ⅲ～Ⅳ级11．11％；血小板减少Ⅰ～Ⅱ级33．33％，Ⅲ～Ⅳ级2．78％；恶心呕吐Ⅰ～Ⅱ级13．89％，Ⅲ～Ⅳ级0．00％。联合组治疗后TAM数量增加例数比率（63．89％）显著多于R-CHOP组（38．89％），差异有统计学意义（χ2＝7．938，P ＜0．05）；联合组 CD68（46.11％）、IL-6（44．44％）、IL-8（58.33％）的阳性表达率显著高于R-CHOP组CD68（13．89％）、IL-6（19.44％）、IL-8（38．89％），差异均有统计学意义（χ2＝3．278、4．021、4．489，均P＜0．05）。结论 R-CHOP联合rhGM-CSF较单纯R-CHOP方案临床疗效更加显著，不良反应更少，且在rhGM-CSF诱导下，单核细胞可发育成M1型巨噬细胞，在DLBCL微环境下，可诱导M2型TAM向M1型发生逆向极化，改善DLBCL的微环境，为DLBCL的治愈提供可能的机会。
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人肝癌特异性EB病毒载体-pEBAF介导hGM- CSF基因的转移及表达
目的：探索人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM - CSF)基因在肝癌细胞中特异性表述的新途径。方法：构建pEBAF/hGM～CSF基因克隆，用脂质体转染法将它分别导入分泌甲胎蛋白(AFP)的肝癌细胞株HepG2和不分泌APF的细胞株SMMC7721,构建两转基因的细胞克隆HepG2/hGM - CSF、 SMMC7721/hGM用MTT比色法测定细胞上清中活性。结果：HepG2/hGM- CSF细胞上清hGM-CSF活性平均为46.5ng/ml/106/24h, SMMC7721细胞上清中无明显hGM～ CSF活性。结论：载体pEBAF介导的hGM-CSF基因能在分泌AFP的肝细胞中获得特异性表达。
关键词： EB病毒表达载体 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 基因治疗 -
链亲和素标记的人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子融合蛋白的制备
目的 制备链亲和素(SA)标记的人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA,并鉴定其生物学活性.方法 构建原核表达质粒PET24a-6His-SA-L-hGM-CSF和PET24a-hGM-CSF-L-SA-6His,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性.复性后蛋白用DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析进一步纯化.MTT法检测融合蛋白对人红白血病细胞(TF-1)的增殖活性.流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的MB49细胞锚定修饰效率.结果 SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA两种融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,目标蛋白占菌体蛋白的20％以上,纯化后纯度达到96％以上.两种融合蛋白均具有双功能活性,即同时具有hGM-CSF的促进人红白血病细胞增殖的活性和SA介导的高效结合至表面生物素化的MB49细胞的功能(锚定修饰率大于99％).结论 研制的SA/hGM-CSF融合蛋白具有双重活性,可为研制hGM-CSF表面修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供基础.
关键词： 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 链亲和素 肿瘤细胞疫苗 融合蛋白 -
特异性溶瘤重组腺病毒KH901对荷瘤鼠肿瘤生长的抑制作用和表达GM-CSF的研究
目的 探讨特异性溶瘤重组腺病毒KH901的抗肿瘤效果及表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平.方法 裸鼠皮下接种人肝细胞癌(Hep3B)细胞或人前列腺癌(LNcap)细胞,建立相应裸鼠移植瘤模型.KH901瘤体内注射给药,同时设阳性对照[5-氟尿嘧啶(5-FU)或顺铂尾静脉注射]和阴性对照[生理盐水(NS)尾静脉注射],以相对肿瘤增殖率(T/C%)和抑瘤率观察抗肿瘤效果;建立人肺癌 (A549) 裸鼠移植瘤模型,瘤体内注射KH901,分别于首次给药后第2、7、11、14、18、36d各取3只动物眶静脉采血并摘取肿瘤,以ELISA法测定血清和肿瘤匀浆液上清中GM-CSF含量.结果 ①在Hep3B裸鼠抑瘤实验中,KH901高剂量(3×1010 VP/鼠)组的T/C%和抑瘤率分别为7.31%、93.61%,与KH901低剂量(3×108 VP/鼠)组(40.27%、68.76%)和5-FU组(37.33%、61.49%)相比显示出较强的抑瘤效果(P＜0.05).②在LNcap裸鼠抑瘤实验中,KH901多次给药(3×1010 VP/鼠×3)组的T/C%和抑瘤率分别为5.47%、95.29%,其抑瘤效果强于顺铂组(25.47%、71.93%),但与KH901单次给药(3×1010 VP/鼠×1)组(12.94%、87.94%)相比差异无统计学意义.③在A549裸鼠移植瘤模型中,肿瘤和血清中的GM-CSF分别在第7d[(47.72±9.21) ng/mg]和第11d[(92.45±18.64) ng/mL]出现高峰,随后,GM-CSF表达量逐渐降低.结论 KH901有明显的抗肿瘤作用,在体内肿瘤中表达高水平的GM-CSF,并渗入血管到循环系统,形成血液GM-CSF的高峰.
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人外周血中树突状细胞的诱导及鉴定
目的从健康人外周血中诱导高纯度树突状细胞(dendritic cell ,DC).方法用贴壁法从健康人外周血获取单核细胞,对传统的诱导方法加以改进,经GM-CSF(100 ng /ml)和 IL-4 ( 500 U/ ml ) 持续诱导7天,在此期间不再补充新的细胞因子、新鲜培养基和促成熟因子,以获取高纯度DC.结果经上述方法处理后,从健康人外周血中诱导出了大量高纯度DC,其能高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子、共刺激分子和粘附分子,显示出成熟DC的特征 .这些 DC能强烈诱导同种异体淋巴细胞的增埴,其内吞能力在第3天达高,之后明显下降.结论本研究所建立的从外周血获取大量成熟DC的方法经济、简便,为DC的深入研究和临床应用奠定了基础.
