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人GM-CSF与EB病毒LMP2A融合基因的构建与鉴定
目的 构建人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因与EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因LMP2A融合基因的原核表达载体. 方法 用随机引物Oligo (dT)15进行RT-PCR,分别获得人GM-CSF和LMP2A编码序列的cDNA.将纯化GM-CSF和EB病毒LMP2APCR扩增产物插入高效克隆载体pMD18 T,并转化入感受态细胞Esche richia coli DH10B,在含有x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基平板上进行蓝白斑选择,测序正确的序列进行剪接式重叠延伸,将目的基因GM-CSF和LMP2A编码经多肽接头(Gly4Ser)3序列连接,构建融合基因GC2A,将GC2A克隆至pMD18-T,转化感受态细胞E.coliDH10B,在含有x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基平板上进行蓝白斑选择.结果 目的基因G M-CSF和LMP2A RT-PCR产物大小分别为470 bp和1 545 bp,与预期值一致.构建的重组质粒经双酶切、扩增及测序鉴定证实,融合基因(1 961 bp)正确插入载体. 结论 融合基因正确插入pMD18-T,并成功转化入感受态细胞E.coli DH10B,为进一步研究奠定了基础.
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GM-SCF与LMP2A融合基因GC2A重组腺病毒载体的构建与鉴定
目的:构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因与EB病毒基因LMP2A融合基因GC2A的重组腺病毒表达载体.方法:将构建的融合基因GC2A定向亚克隆至质粒pAdTrack-CMV上,经酶切及电泳检测后,PmeL酶切pAdTrack-CMV-GC2A,与质粒pAdEasy-1一起电转化E.coli.BJ5183,筛选重组菌,经Pac Ⅰ酶切鉴定后用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组腺病毒vAd-GC2A,采用pAdTrack-CMV-GC2A中报告基因GFP的表达,观测其表达情况.结果:采用内切酶Bg1Ⅱ和EcoR Ⅴ对质粒pAdTrack-CMV-GC2A进行双酶切分析,电泳后可观察到约1 961和9 200 bp的片段.重组腺病毒载体经Pac Ⅰ酶切后观察到约33 kb的DNA片段和4.5 kb的DNA片段,说明pAdTrack-CMV-GC2A和pAdEasy-1的重组发生在ori和右臂区,pAd-GC2A经Pac Ⅰ酶切线性化后,磷酸钙法转染293细胞,56 h后在荧光倒置显微镜下可看到有绿色荧光出现,说明已转染成功,并能在293细胞中表达.结论:融合基因GC2A正确插入,真核表达栽体vAd-GC2A成功构建,在293细胞中包装获得重组腺病毒.
关键词： 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 融合基因GC2A 基因重组 腺病毒载体 -
GM-CSF和EB病毒LMP2 A融合基因的表达及抗肿瘤特性研究
目的：构建GM-CSF和EB病毒LMP2A融合基因的重组腺病毒，对重组腺病毒进行鉴定及免疫学研究。方法：采用RT-PCR及Western blot方法检测重组腺病毒GC2A基因表达，用ELISA方法对vAd-GC2A刺激小鼠产生的抗体水平进检测及分析，乳酸脱氢酶法检测其对小鼠的细胞免疫功能的影响，采用t检验方法对重组腺病毒的免疫效果进行初步分析和评价。结果：PCR扩增重组腺病毒GC2A片段大小为1961 bp，与预期结果一致；蛋白质印迹法检测结果显示，重组腺病毒vAd-GC2A表达的蛋白能被血清GM-CSF抗体（或LMP2A抗体）识别；ELISA检测结果表明，vAd-GC2A能刺激机体产生抗体，随着免疫时间的延长，重组腺病毒刺激机体产生的抗体增长较快；重组腺病毒诱导的CTL对EBV阳性肿瘤细胞的杀伤率为（66.7±6.9）％，而腺病毒5型野毒株和PBS的杀伤率分别为（24.3±2.5）％和（32.4±3.1）％（P≤0.05）。结论：构建的重组腺病毒可表达GC2A基因，vAd-GC2A在小鼠体内可激活体液免疫和细胞免疫功能，有望成为预防和治疗EB病毒阳性肿瘤的新手段。
