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血凝素蛋白裂解位点对H5亚型禽流感病毒侵入细胞的影响
目的 通过RT-PCR反应获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3上,通过转染293T细胞进行了瞬时表达验证.方法 采用PCR定点突变技术,将其HA基因裂解位点的氨基酸组成由RKKR↓GLF突变为RSSR ↓ GLF,使其具有低致病性AIV的分子特征,并构建了表达突变后HA基因的真核表达载体pcDNA-Hm.将pcDNA-H5和pcDNA-Hm分别与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T后,收集转染细胞上清,通过Western-blot和细胞感染性实验来研究假病毒的特性.用缺乏囊膜蛋白和已经证实可以形成MuLV假病毒的水泡性口炎病毒糖蛋白G作为对照.结果 转染后形成假病毒进行裂解后进行Western-blot证明两种HA蛋白都能够整合到各自的假病毒颗粒表面,野生型的HA可以检测到三条带,分别与HA0、HA1和HA2大小相符,而突变后的HAm则仅能检测到一条带,与HA前体大小相符,说明其失去了裂解活性.通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞后发现野生型的HA所形成的假病毒MuLV-H5具有感染性和泛嗜性,而突变后的HA所形成的假病毒则失去了感染性.结论 可以得出HA蛋白裂解位点的氨基酸组成不仅对H5亚型禽流感病毒的致病性有影响,对禽流感病毒侵入细胞也具有至关重要的作用.
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云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒遗传多样性分析
目的 了解云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒遗传多样性.方法 2009-2011年7月在云南省边境地区采集境外家禽和野生鸟类棉拭子样品,经H5/Nl亚型特异性多重RT-PCR检测,阳性样品进行病毒HA基因扩增,克隆至pMD 18-T载体测序,并与已知参考毒株进行序列比对及系统发育分析.结果 36份阳性样品病毒HA基因测序获得15种HA序列,存在2个不同进化分支(2.3.2、2.3.4),2.3.2进一步可划分为3个进化小分支(Ⅱ-1～Ⅱ-3),2.3.4进一步可划分为2个进化小分支(Ⅰ-1和Ⅰ-2).2.3.2Ⅱ-1、Ⅱ-2毒株是新出现的H5N1亚型病毒变异株.结论 2009- 2011年7月云南省边境地区H5N1亚型病毒具有遗传多样性,病毒经历了多分支(2.3.2、2.3.4)至单一支(2.3.2)的进化过程.
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云南边境地区禽流感H5N1亚型病毒NS基因进化分析
目的 阐明云南边境地区禽流感H5N1亚型病毒NS1 、NS2基因变异特征及遗传进化关系.方法 在云南边境地区采集境外家禽和野生鸟类棉拭子样品,经H5N 1亚型特异性多重RT-PCR检测,阳性样品对病毒NS基因进行扩增,克隆至pMD 18-T载体测序,获得NS1、NS2基因序列,并与已知参考毒株序列进行序列比对及系统发育分析.结果 自1240份样品中检出H5N1亚型阳性样品71份,阳性率为5.72％；30份代表性阳性样品病毒NS基因测序获得17种序列,存在3个不同进化(亚)分支(Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ)；NS1/NS2基因与病毒血凝素(HA)基因呈现不同进化关系；NS1蛋白涉及核定位信号区、RNA结合区、效应区及其他致病性相关的关键性氨基酸位点存在替代或突变.结论 云南边境地区H5N1亚型病毒NS1/NS2基因具有遗传差异,2010年以来NS基因进化分支Ⅰ-2、Ⅱ已成为当地流行的优势毒株.
关键词： 禽流感病毒 H5N1亚型 非结构蛋白1 非结构蛋白2或核输出蛋白 遗传分析 -
云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒基质蛋白2基因进化分析
目的 了解2008-2012年云南省边境地区禽流感H5NI亚型病毒基质蛋白2(M2)和离子通道蛋白基因变异特征及遗传进化关系.方法 于2008-2012年采集云南省边境地区(越南、老挝、缅甸与云南省交界处)家禽和野生鸟类棉拭子样品1240份,经H5N1亚型特异性多重RT-PCR检测,对阳性样品病毒M基因进行扩增,克隆至pMD18-T载体测序,获得M2基因序列,并与已知参考毒株序列进行序列比对及系统发育分析.结果 自1240份样品中检出H5N1亚型阳性样品71份,阳性率为5.72％；选择其中的30份阳性样品进行病毒M2基因测序,共获得14种不同序列,存在3个不同进化分支:1.2.1、1.2.2、2,各有5、7、2份.通过基因系统发育分析发现,M2基因与HA基因呈现不同进化关系；M2蛋白涉及表位、金刚烷胺抗性和禽源、人源毒株的关键性氨基酸位点存在替代或突变.结论 2008-2012年期间云南边境H5N1亚型病毒M2基因具有遗传差异,M2基因进化分支1.2.2毒株已成为当地流行的优势毒株.
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亚非五个国家人感染高致病性H5N1禽流感的流行特征比较
目的 分析埃及、印度尼西亚、柬埔寨、中国和越南人感染H5N1禽流感病例的流行特征.方法 通过查找公共数据源和已发表文献,收集1997年5月1日至2017年11月6日间,5个国家报告的全部人感染H5N1禽流感病例的信息进行分析,包括一般特征、诊断、发病及暴露史等信息.描述5个国家感染病例及死亡病例的特征分布,采用χ2检验比较各国家间死亡病例特征的差异;同时采用OR(95％CI)值比较不同国家的病例死亡的危险性.结果 5个国家共报告人感染H5N1禽流感病例856例,其中埃及多(44.3％);5个国家总报告病例数多的年份为2015年(18.3％),月份为1—3月份(53.0％);96.1％的病例发病前有明确的禽类暴露史,64.2％(43例)的中国病例发病前去过活禽市场,而其他4个国家病例以病/死禽暴露为主.5个国家共报告死亡病例452例,总病死率为52.8％.与埃及相比,印度尼西亚病例死亡的OR(95％CI)值为11.52(7.46～17.77),柬埔寨为4.27(2.37～7.69),中国为2.87(1.73～4.74).5个国家间死亡病例的年龄分布差异有统计学意义,其中,埃及病死率高发生在15～54岁年龄组(83.6％,102例),而柬埔寨则是0～14岁年龄组高(76.9％,30例).5个国家死亡病例报告多的年份为2016年,月份为1—3月(48.3％).5个国家死亡病例的暴露方式存在差异(χ2=43.85,P=0.001),中国以活禽市场暴露为主(63.2％,24例),印度尼西亚以病死禽暴露为主(92.9％,79例),埃及以家禽暴露为主(81.6％,31例),越南以病死禽暴露为主(83.3％,40例),柬埔寨以病死禽暴露为主(100.0％,38例).结论 亚非5个国家的人感染H5N1禽流感疫情在地域分布、高发季节、年龄、性别和禽类暴露方式以及发病结局等方面均有所不同.
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云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒血凝素基因变异特征分析
2006年以来全球H5N1亚型疫情报道呈逐年递减趋势,但与云南省接壤或相邻的东南亚及南亚国家,高致病性禽流行性感冒(简称禽流感)疫情及人感染病例每年均有发生,逐渐显现出地方流行态势,成为全球高致病性禽流感分布流行的主要区域,难以根除[1],且已对云南省动物健康和公共卫生安全构成了严重威胁.开展云南省边境地区禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因结构及变异特征分析,对禽流感病毒研究及疫病监测防控有重要意义.
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2009年广西农贸市场环境标本禽流感病毒的病原学监测
1997年中国香港首次发生人禽流感(H5N1)疫情,引起全球关注.2005年11月广西首次报告一起人禽流感(H5N1)疫情,至2009年广西共累计报告3例人禽流感(H5N1)病例[1-2].为了解禽流感病毒在广西人群及高危环境中的感染分布情况,近年来全面加强了禽流感疫情监测,现将广西2009年农贸市场环境禽流感H5N1亚型病毒病原学的监测情况报道如下.
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用液相芯片方法同时检测流感病毒H5N1和H7N9亚型
基于液相芯片(Multi-analyte suspension array,MASA)技术建立一种同时对H5N1和H7N9亚型流感病毒进行快速检测的新方法.对国家生物技术信息中心(National center for biotechnology information,NCBI)和欧洲生 物信息学中心(The european bioinformatics institute,EBI)核酸数据库中已有的H5、N1、H7和N9核酸片段进行比对分析,并参考世界卫生组织,美国疾病预防控制中心和中国疾病预防控制中心等的相关资料,设计简并引物和探针,将合成的探针与荧光编码微球进行偶联,建立检测方法.利用该方法检测H5N1和H7N9亚型流感病毒和其它常见亚型(H1N1、甲流H1N1、H5N2、BH3N2和H9N2)的标本.建立了一种快速的流感病毒分型方法.这种方法可以同时检测H5N1和H7N9,用已知基因型的样本对这种方法进行验证显示它的特异性很好.灵敏度分析实验也表明这种方法具有很高的灵敏度,可以对含有5个拷贝的样本进行有效的检测.利用液相芯片技术研制的H5N1和H7N9亚型流感病毒检测方法能够用于流感病毒H5N1和H7N9亚型的快速、灵敏、特异性的检测及鉴定.
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高滴度感染力H5N1亚型禽流感病毒假病毒颗粒的制备
利用一个瞬时共转染系统,将H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白整合到鼠白血病病毒假病毒颗粒表面,包装成表达HA与NA的假病毒颗粒,通过透射电子显微镜形态学观察、感染滴度分析、血凝试验和中和试验研究其生物学特性.研究获得了高滴度感染力的H5N1假病毒颗粒(H5N1 Pseudotyped particle,H5N1Pp),H5N1Pp的感染力滴度为108 Pp/mL,形态、血凝活性及中和特性均与野生H5N1病毒相似,结果为H5N1病毒受体、HA与NA的功能、中和抗体、抗病毒药物开发研究的开展建立了平台.
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我国首例孕妇感染高致病性禽流感(H5N1)的病原学研究
对2005年11月8日安徽省铜陵市人民医院报告的一例孕妇不明原因肺炎病例的死亡病因进行研究.采集病人的气管吸出物及血液标本,用RT-PCR和Real-time PCR方法检测流感病毒A/M、A/H5N1、A/H7N7、A/H9N1亚型特异性核苷酸片段;气管吸出物接种SPF鸡胚进行病毒分离,并对分离物进行鉴定和序列测定及分析;利用血凝抑制试验检测血清标本抗体.结果表明病人气管吸出物可以检测到甲型流感病毒M片段及H5亚型的特异性HA基因.2005年11月9日采集的血清标本用Real-time PCR检测到甲型流感病毒M基因.从病人的气管吸出物中分离到H5N1病毒(A/Anhui/1/2005),对病毒的HA基因序列结果进行分析表明病毒是禽源的,其主要依据是受体结合位点第226～228位氨基酸位点(QSG)为禽流感病毒所特异,HA受体连接肽仍为9个碱性氨基酸(LRERRRKRP);基因进化树分析显示,HA基因与禽源病毒进化距离接近.发病后7、8、9d的血清H5N1禽流感病毒HI抗体小于20.对该病例的病原学研究证明,该病例为H5N1禽流感感染病例.
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家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒NS基因分析
对长沙市家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)的非结构蛋白(Nonstructural,NS)基因进行进化和分子特征分析,探讨污水中H5N1病毒的传播风险.9份家禽市场环境污水H5N1亚型AIV标本进行NS基因TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行氨基酸(amine acid,aa)比对和进化树分析.共得到8个阳性克隆,进化树构建显示8个H5N1的NS基因均属于A亚群,其编码的NS1和NS2蛋白与A亚群代表株(A/chicken/ Hubei/w h/ 1999)aa同源性分别为90.1％～92.5％和91.0％～92.6％,8个H5N1的NS1和NS2 aa之间的同源性分别为93.8％～100.0％和98.4％～100.0％.8个H5N1的NS1蛋白均具有缺失80～84位aa、C末端携带有ESEV的PL基序和第92位aa为E的高致病性分子特征.家禽市场污水来源的H5N1亚型AIV的NS基因具有高致病性的分子特征,这种基因特征表明污水可能传播H5N1病毒.
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H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及其诱导肺腺癌细胞A549凋亡的研究
通过RT-PCR的方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并构建了真核表达载体pCMV-Myc/NS1.将此真核表达质粒转染肺腺癌细胞A549,48 h后,经Western印迹检测,NS1基因能在细胞中正确表达.经荧光显微镜、透射电镜观察和流式细胞仪检测,发现该株流感病毒的NS1蛋白可诱导肺腺癌细胞A549凋亡.
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山东省首例人禽流感病例的诊断过程分析
目的 对2009年1月15日山东省济南市发生的1例人禽流感病例进行实验室诊断过程分析,探讨实验检测过程中遇到的问题. 方法 采集病人咽拭子和呼吸道吸取物标本,利用RT-PCR和real-time RT-PCR检测病毒核酸. 结果 第2次采集的咽拭子标本采用H5HA引物的RT-PCR扩增呈阳性;呼吸道吸取物分别用H5NA等3对引物进行RT-PCR均阳性,real-time RT-PCR阳性. 结论 该患者为人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)实验室确诊病例.呼吸道吸取物是禽流感病毒核酸检测的合适标本.
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禽流感病毒H5N1亚型血凝素氨基酸序列的变异分析
目的 研究不同来源禽流感病毒H5N1亚型血凝素(hemagglutinin,HA)氨基酸序列的变异及变异规律. 方法 以GenBank公开的禽流感病毒H5N1亚型HA氨基酸序列为材料,利用生物信息学的手段分析其同源性及氨基酸变异规律. 结果 46个禽流感病毒H5N1亚型HA氨基酸序列之间的同源性为90%～100%;同一地区来源的氨基酸之间的同源性大于异地来源的同源性;在H5N1亚型HA氨基酸序列中,天冬酰氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸和天门冬氨酸常发生突变. 结论 禽流感病毒H5N1亚型血凝素氨基酸序列的变异呈现出一定的规律.
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单扩溶血技术在禽H5N1流感诊断中的应用
目的了解单扩溶血技术对禽H5N1流感病毒抗原测定的佳条件,以便使禽H5N1病毒抗体测定能在普通实验室内进行.方法比较不同浓度,不同品种红细胞,琼脂糖种类和浓度对测定敏感性的影响,以及对该法的敏感性和特异性与微量中和试验进行了比较.结果单扩溶血技术测定佳条件为:病毒浓度为:1000 HA单位/0.1 ml浓鸡红细胞;琼脂糖浓度为:1.0%;补体采用后加法.该法的敏感性和特异性不亚于微量中和试验,同时未发现H1N1,尤其N1抗体对H5N1抗体测定有影响.结论单扩溶血技术对禽H5N1病毒抗体测定的敏感性和特异性不亚于微量中和试验,并能在普通实验室对大量血清样本进行测定.
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中国大陆首例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)病例的实验室诊断
目的对2005年10月湖南省湘潭市湘潭县发生的一名不明原因肺炎病例进行实验室检测,以确定导致该病例的主要病因.方法采集病例呼吸道标本以及血清标本,对呼吸道标本利用分子鉴别诊断技术以及RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测病毒核酸;通过血凝抑制试验以及微量中和试验检测血清中的特异性抗体.结果该病例所有的呼吸道标本H5N1病毒特异性核酸及病毒分离均为阴性.红细胞凝集抑制及微量中和实验显示,恢复期血清较急性期血清H5N1特异性抗体阳转并且有4倍以上增高.结论通过实验室检测结果分析,该病例为中国大陆第一例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)实验室确诊病例.
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M2蛋白疫苗作为流感广谱疫苗的研究进展
2003年以来,H5N1亚型高致病性禽流感病毒先后在几十个国家暴发,其中有14个国家发现人感染禽流感的病例,甚至出现死亡的情况.时隔不久,2009年3月甲型H1N1流感在墨西哥暴发,这个病毒具有很强的传染性,短时间内在全球迅速蔓延,给世界各国带来了恐慌.
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成人H5N1亚型禽流感重症肺炎影像评价及远期随访
目的 探讨成人H5N1亚型禽流感重症肺炎的影像学表现,并评价其远期影像学随访特点.资料与方法 回顾性分析2006～2011经临床确诊的4例H5N1人感染禽流感患者的临床及影像资料,并行X线及CT半定量评分.结果 4例患者中,痊愈2例,死亡2例,1例随访达5年.影像学表现:4例于发病初期影像学表现为局限性磨玻璃影或实变影,迅速发展为两肺实变及磨玻璃影,甚至广泛融合实变影;3例恢复期主要表现为实变及间质纤维化改变,恢复后期及痊愈后随访表现以间质纤维化、支气管扩张为主.发病早期(4～6 d),胸片评分6～9分,CT评分9～1 5分;发病7～12d,胸片评分≥16分,其中死亡患者评分持续在22～24分;发病12d以后,3例均伴发感染,1例合并气胸,胸片评分16～20分;2例随访1年、5年,其CT评分为1分、3分.1例随访5年,高分辨率CT表现仍见纤维条索影,淡薄磨玻璃影,蜂窝状、串珠状及扭曲支气管扩张改变,纵隔及胸膜下肺气肿等.结论 影像学评分能较直观地反映H5N1亚型禽流感重症肺炎的动态变化,有助于分析病情;远期随访仍见遗留病灶可能与肺部不可逆损伤程度有关.
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H5N1型高致病性禽流感肺炎的X线与CT表现1例
1 病例简介患者男,39岁,司机,发热、咳嗽4d,腹泻2d入院.患者入院前4d无明显诱因出现发热,体温39.4℃,偶有畏寒,无气促、胸痛,自服药物(具体不详)无明显好转;2d前出现黑色稀水便,给予头孢呋辛钠降温抗感染处理,体温短暂下降后发热症状反复,咳嗽加重.入院当天(2011-12-25)再次出现腹泻,为黄色稀水便.体格检查:意识清晰,面部、口唇无发绀,咽充血,扁桃体无肿大,胸廓对称无畸形,右前胸第三肋间以上叩诊浊音,呼吸音减弱,语颤增强.
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广东人类禽流感H5N1亚型血凝素和神经氨酸酶基因同源性分析
目的 采用生物信息学技术,寻找广东地区人类禽流感H5N1亚型基因同源毒株.方法 检测广东人禽流感H5N1亚型HA和NA基因核苷酸序列,从GenBank下载国内各种动物和人类相应基因序列,采用Mega 5.03和Lasergene 7.1软件进行核苷酸同源性和氨基酸变异分析.结果 在总共174个HA基因和173个NA基因序列中,发现广东毒株A/Guangdong/01/2006的HA和NA基因与湖南鸡和安徽鸭流感毒株同源性较高;广东毒株A/Guangdong/02/2006的HA和NA基因与香港鸟禽类流感毒株同源性较高.同源性较高的毒株基因之间,氨基酸位点存在差异,但尚未显示流行病学和临床意义.结论 广东A/Guangdong/01/2006毒株与湖南鸡和安徽鸭流感毒株具有共同的近祖先,广东A/Guangdong/02/2006毒株与香港鸟禽类流感毒株具有共同的近祖先.
