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云南边境地区禽流感H5N1亚型病毒NS基因进化分析
目的 阐明云南边境地区禽流感H5N1亚型病毒NS1 、NS2基因变异特征及遗传进化关系.方法 在云南边境地区采集境外家禽和野生鸟类棉拭子样品,经H5N 1亚型特异性多重RT-PCR检测,阳性样品对病毒NS基因进行扩增,克隆至pMD 18-T载体测序,获得NS1、NS2基因序列,并与已知参考毒株序列进行序列比对及系统发育分析.结果 自1240份样品中检出H5N1亚型阳性样品71份,阳性率为5.72％；30份代表性阳性样品病毒NS基因测序获得17种序列,存在3个不同进化(亚)分支(Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ)；NS1/NS2基因与病毒血凝素(HA)基因呈现不同进化关系；NS1蛋白涉及核定位信号区、RNA结合区、效应区及其他致病性相关的关键性氨基酸位点存在替代或突变.结论 云南边境地区H5N1亚型病毒NS1/NS2基因具有遗传差异,2010年以来NS基因进化分支Ⅰ-2、Ⅱ已成为当地流行的优势毒株.
关键词： 禽流感病毒 H5N1亚型 非结构蛋白1 非结构蛋白2或核输出蛋白 遗传分析 -
登革病毒非结构蛋白1结构及功能研究进展
登革病毒(Dengue virus,DENV)是一种严重威胁我国南方地区公众健康的虫媒病毒,无特异性的治疗方法和疫苗.单纯的登革病毒结构蛋白疫苗不能诱导针对四种血清型DENV的均衡、持久的保护性免疫,可能需要非结构蛋白成分.DENV非结构蛋白1(Non-structural 1 protein,NS1)在登革病毒致病和保护性机制中具有重要的作用,该蛋白诱导的免疫可能在防治登革疾病中具有重要的作用.本文就DENV NS1结构及功能的研究进展作一综述.
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探究黄热病毒NS1蛋白在感染早期的诊断价值
为了探讨黄热病毒 (Yellow fever virus, YFV) 非结构蛋白1 (Nonstructural protein 1, NS1) 在感染早期的诊断价值.颅内注射YFV-17D感染乳鼠, 每日处死1窝, 收集抗凝血.Vero细胞和C6/36细胞感染YFV-17D病毒后, 每隔12h收集培养上清.分别采用荧光定量PCR和基于YFV NS1多克隆抗体的双抗体夹心酶联免疫 (Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 方法检测感染后乳鼠血液、C6/36和Vero细胞上清中YFV的扩增情况和NS1蛋白的分泌规律.乳鼠感染YFV-17D后第2d在血清中即可检测到YFV NS1, 第3d血液中检测到YFV核酸.敏感细胞株在感染YFV-17D后第36h培养上清中可检测到YFV NS1, 而48h后才能检测到YFV核酸.YFV NS1蛋白具有作为YFV感染早期的诊断靶标的潜在价值.
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流行性乙型脑炎病毒非结构蛋白1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达
目的 获得流行性乙型脑炎(乙脑)病毒非结构蛋白1(Non-structural Protein 1,NS1)基因并在昆虫细胞中表达,为研制乙脑病毒基因工程疫苗奠定基础.方法 逆转录-聚合酶链反应扩增乙脑病毒NS1基因并测序列,定向克隆入杆状病毒(Baculovirus,BV)转移载体pFastBac HTa,获得重组转移载体pFastBac-NS1.并将pFastBac-NS1转化到DH1OBac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1.在脂质体介导下将rBacmid-NS1 转染粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni,TN)细胞获得重组BV(rBV-NSI).rBV-NS1感染TN细胞后,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacryamide Gel Eleetrophoresis,SDS-PAG)、间接免疫荧光试验(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)和蛋白质印迹法(Western blotting,WB)检测NS1 重组蛋白.结果 成功克隆乙脑病毒NS1 基因,SDS-PAGE、IFA和WB检测表明,NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与乙脑患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性.结论 乙脑病毒NS1 在昆虫细胞中表达,为研究NS1 的生物学特性和研制基因工程疫苗奠定了基础.
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蜱传森林脑炎病毒非结构蛋白1原核表达载体的构建
目的:构建蜱传森林脑炎病毒(TBEV)非结构蛋白1(NS1)的原核表达载体,以期获得其高纯度的表达,为制备多克隆抗体及其功能的研究奠定实验基础.方法:根据目的基因序列设计PCR引物,利用基因重组技术构建原核表达载体pEASYTM-E1-NS1.将重组后质粒pEASYTM-E1-NS1转化至BL21细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后进行镍离子亲和纯化,利用Bradford法测定蛋白浓度.采用SDS-PAGE和Westernblotting法分析融合蛋白的表达水平.结果:含TBEV NS1的原核表达载体pEASYTM-E1-NS1经诱导后,可获得以包涵体形式存在的融合蛋白,通过亲和纯化得到较高纯度的蛋白质.SDS-PAGE和Western blotting,在相对分子质量约40 000处有特异性蛋白条带.结论:成功构建重组pEASYTM-E1-NS1原核表达载体,获得高纯度的重组TBEV NS1的融合蛋白.
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甲型流感病毒非结构蛋白N S1功能研究进展
甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)是每年季节性流感的主要病原体,也是全球儿童急性呼吸道感染的重要病毒性病原.非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)是由病毒基因组编码的蛋白,表达于被感染的细胞中,但不存在于病毒颗粒中.近年来,大量研究表明NS1是IAV的重要毒力因素,通过NS1-RNA之间、NS1-蛋白之间的相互作用,在拮抗宿主抗病毒反应、抑制宿主细胞凋亡、调节宿主及自身基因表达等多方面发挥作用.深入研究NS1与宿主细胞的相互作用,不仅可加深对IAV致病机制的理解,还可为预防和控制IAV的传播甚至暴发奠定理论基础,在新型抗病毒药物及疫苗研制中有着重要的应用价值.
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人细小病毒B19 NS1片段全长的克隆及表达
目的:克隆人细小病毒B19非结构蛋白1(NS1)全长基因,构建重组表达载体并诱导表达. 方法: 利用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,从我科保存的B19阳性标本XA20中扩增NS1片段全长,构建NS1-pGEM-T-easy克隆载体并测序分析,测序证实序列正确后亚克隆于pQE30表达载体中,并转化至M15感受态菌中,经IPTG诱导可表达77000的融合蛋白. 结果:成功克隆了人细小病毒B19 NS1全长基因,构建了融合蛋白NS1-pQE30的重组表达质粒,表达的融合蛋白经12%SDS-PAGE电泳证实为77000. 结论:获得人细小病毒B19 NS1全长基因及原核表达产物,对进一步研究NS1的生物学活性及其单克隆抗体的制备有重要意义.
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Ⅱ型登革病毒非结构蛋白1多克隆抗体制备和免疫特征分析
目的 制备抗Ⅱ型登革病毒(dengue virus type 2,DENV2)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)多克隆抗体,分析该抗体的免疫特性. 方法 采用NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,取血分离血清,纯化获得抗NS1抗体.酶联免疫吸附试验法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析抗NS1抗体与NS1蛋白和DENV2结合特性.免疫荧光法测定抗NS1抗体与人微血管内皮细胞株1(human microvascular endothelial cell 1,HMEC-1)的交叉反应性.ELISA法分析抗NS1抗体、HMEC-1和新鲜同系小鼠血清共培养体系中活化补体的含量. 结果 抗NS1抗体能与NS1和DENV2特异性结合,抗体高滴度分别为1:1 280和1:540.抗NS1抗体能与HMEC-1细胞交叉结合,抗NS1抗体、HMEC-1和新鲜同系小鼠血清共培养上清液中C3a、C4a、CSa和sC5b-9含量均显著高于HMEC-1和新鲜同系小鼠血清共培养(均P＜0.05),以及PBS、HMEC-1和新鲜同系小鼠血清共培养(均P＜0.05).结论 抗DENV2 NS1抗体能交叉结合于血管内皮细胞并激活补体系统,可能在登革出血热的免疫病理机制中起重要作用.
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1型登革病毒初次感染患者血清中和抗体的动态反应分析
目的 研究感染登革病毒(DENV)后,机体DENV中和抗体产生的特点及其动态变化规律.方法 采集2006年DENV-1初次感染患者在发病2周之内的,以及同一组患者在2010年随诊期间的血清标本,用本实验室建立的以群特异性DENV NS1抗原捕获ELISA为基础的,可同时测定4型DENV中和抗体的微中和试验(ELISA-MNT),对这两组血清中的DENV中和抗体滴度进行检测.这两组血清标本均检测了全部抗4型DENV的中和抗体.此外,2010年的血清标本还检测了抗3种不同毒株的DENV-1(其中包括1株标准株和2株临床分离株)的中和抗体.结果 2006年和2010年这两组不同时间段的血清标本对全部4型DENV均可显示出一定程度的交叉中和抗体反应,其中,2006年的血清标本交叉中和抗体反应更为明显,表现为其高的中和抗体针对的甚至是DENV-2,而不是预计中的DENV-1; 2010年的血清标本中高的中和抗体滴度针对的是同型的DENV-1.Mann-whitney U检验显示:对于同型的抗DENV-1中和抗体滴度,2010年的血清要明显高于2006年的血清(U=86.500,P=0.000),但异型中和抗体滴度在两组血清标本中无明显改变.Friedman检验显示,尽管同属DENV-1,但2010年的血清标本对3种不同毒株的DENV-1的中和抗体滴度之间还是存在显著差异(x2=12.123,P=0.002).结论 4型交叉中和抗体反应是D ENV感染后,尤其是在感染早期中和抗体的产生特点,但只有同型DENV中和抗体滴度可随时间的推移而发生明显的上升；然而即使是同属于一种血清型,不同毒株之间的中和抗体也可能存在差异.
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Ⅲ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及鉴定
目的 研制Ⅲ型登革病毒(DV3)非结构蛋白1(NS1)单克隆抗体,鉴定其血清型特异性.方法 以具有良好抗原性的重组DV3-NS1蛋白与DV3交替免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光(IFA)和Weatern Blot对抗体的特异性进行鉴定.结果 经交替免疫法免疫Balb/c小鼠,共获得14株抗DV3-NS1单抗,其亚类测定1株为IgG2a,余为lgG1.其中3株特异性结合DV3及DV3-NS1蛋白,4株能同时结合4型登革病毒NS1蛋白,其余7株与其他3型登革病毒NS1蛋白存在交叉反应.结论 成功获得了针对DV3-NS1的特异性单抗及交叉性单抗,将为进一步研究登革病毒NS1蛋白的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定基础.
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人微小病毒B19非结构蛋白1损伤细胞机制的研究进展
人微小病毒B19(human parvovirus B19)于1975年在筛选健康献血者血液中乙型肝炎病毒时偶然发现,并因此而得名.该病毒是一种DNA病毒,无被膜,长约5.5 kb,分子质量约50～80 ku,是对称二十面体,平均直经约25 mm,它是微小病毒科微小病毒属的成员(微小病毒科还包括依赖性病毒属和浓核病毒属),是该属病毒中惟一能使人类致病的病毒,也是动物病毒中体积小、结构简单的DNA病毒.B19病毒有两种衣壳蛋白VPl(83 ku)、VP2(58 ku)及一个主要非结构蛋白(non-structural protein-1 NS1).VP2的氨基酸序列包含在VP1氨基酸序列中,它们组成衣壳包裹在B19的DNA表面,构成B19病毒的抗原性,而NS1则与B19病毒毒力有关.
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轮状病毒非结构蛋白1与种属限制性的相关性研究
目的 研究轮状病毒(rotavirus,RV)非结构蛋白1(nonstruetural protein 1,NSP1)与种属限制性的相关性,探讨NSP1在RV种属限制性机制中的作用. 方法 对UniProt数据库中的RV NSP1 C末端、伞序列以及GenBank数据库中NSP1基因的3′端非编码序列利用DNAStar(Lasergene)7.1软件进行种属间和种属内的序列比对和进化树分析.结果NSF1种属间的多样性与RV宿主特异性一致,NSP1的C末端、NSP1基因3′端非编码序列与NSP1全序列种属内的一致性较高,且高于种属间一致性(P<0.01). 结论 NSP1与RV种属限制性密切相关.NSP1与宿主特异的干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)相结合的特性和RV的种属限制性相关,其结合区域可能是决定RV种属限制性的关键区域.,NSP1基因3′端非编码序列可能在基因水平参与调控RV种属限制性.
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寨卡病毒非结构蛋白1的真核表达纯化和免疫反应性鉴定
目的 在HEK293F细胞中表达寨卡病毒(Zika Virus,ZKV)的非结构蛋白1(Nonstructural Protein 1,NS1),并分离纯化得到重组ZKNS1以及验证其免疫反应性.方法 根据Gen Bank中的ZKNS1序列合成基因,在基因上下游分别引入信号肽和组氨酸标签,通过Not I和Xba I双酶切将基因克隆至pc DNA3.1(+)载体;将重组载体转染HEK293F细胞,重组蛋白用镍亲和柱层析纯化;免疫印迹法(Western blot)鉴定重组ZKNS1与寨卡病毒阳性人血清的免疫反应性.结果成功构建了ZKNS1的真核表达载体pc DNA3.1(+)-ZKNS1;在HEK293F细胞中重组ZKNS1以分泌形式表达于细胞培养上清中,经纯化后获得了纯度较高的分子量约为46k Da的重组蛋白;Western blot结果显示重组ZKNS1与寨卡病毒阳性人血清能发生特异性结合.结论 成功构建ZKNS1的真核表达载体,获得了免疫反应性较高的纯化的重组ZKNS1,为进一步建立ELISA检测方法及制备单克隆抗体奠定了基础.
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抗Ⅳ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及特性鉴定
目的:研制Ⅳ型登革病毒(DENV-4)非结构蛋白1(NS1)特异性的单克隆抗体(mAbs),并鉴定其特异性.方法:在表达具有良好抗原性的重组DENV4-NS1蛋白的基础上,用重组DENV4-NS1蛋白和灭活的DENV-4免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光测定法(IFA)和Western blot分析对mAb的特异性进行鉴定;通过竞争抑制试验对mAb识别的抗原位点进行分析.结果:获得15株特异性针对DENV4-NS1的mAbs,与其他3型DENV的NS1不产生交叉反应.mAb的Ig亚类测定均为IgG1.竞争抑制试验显示,15株mAb8存在2个不同识别抗原位点.结论:成功地获得特异性针对DENV4-NSI蛋白的mAbs,为进一步研究DENV4-NS1蛋白的结构与功能及研制DENV-4的临床诊断试剂奠定了基础.
