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云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒血凝素基因变异特征分析
2006年以来全球H5N1亚型疫情报道呈逐年递减趋势,但与云南省接壤或相邻的东南亚及南亚国家,高致病性禽流行性感冒(简称禽流感)疫情及人感染病例每年均有发生,逐渐显现出地方流行态势,成为全球高致病性禽流感分布流行的主要区域,难以根除[1],且已对云南省动物健康和公共卫生安全构成了严重威胁.开展云南省边境地区禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因结构及变异特征分析,对禽流感病毒研究及疫病监测防控有重要意义.
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甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素HA1氨基端的表达及双抗体夹心ELISA法的建立
甲型H1N1流行性感冒(简称流感)病毒是一种人类常见的流感病毒之一,2009年引起流感大流行的病毒并非一种全新的流感病毒[1],陆一涵等[2]推测可能是北美地区的H1N4病毒发生了一定程度的变异(包括重组和重排)所致。基因组测序发现,该病毒包含禽流感、猪流感和人流感3种流感病毒的基因片段[3-4],其中血凝素(HA)蛋白来源于猪谱系,一直存在于经典猪流感病毒和三源重排子猪流感病毒中[5]。HA蛋白是流感病毒主要的表面抗原,与病毒吸附穿膜及宿主对病毒易感性有关[6-8],其变异率较高,常通过突变使病毒逃脱宿主免疫引起新的流感大流行。这种变异主要体现在HA1氨基端球形头部的受体结合部位与抗原决定簇氨基酸的改变,因此甲型H1N1病毒HA1氨基端蛋白的表达是建立特异性检测方法的关键。笔者通过原核表达此次甲型H1N1流感病毒血凝素HA1氨基端蛋白,制备多抗血清,建立了特异性双抗体夹心ELISA检测法。
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甲型H1N1流感病毒裂解疫苗引起心悸、血压升高1例
病例:患者,男,43岁,既往体健,否认药物及食物过敏史.2009年11月5日,按计划先禁食到医院体检,当时测血压(BP) 110/70mmHg(1mmHg=0.133kPa ).体检结束后遂接种甲型HIM流感病毒疫苗.接种剂量:0.5mL,含甲型HIN1流感病毒血凝素15 Rg.
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接种甲型H1N1流感病毒裂解疫苗引起不良反应1例
病例:接种者,男,78岁,有高血压、美尼尔氏综合症病史及油漆过敏史,日服非洛地平缓释片5mg以控制血压.于2009年9月17日上午9;10上臂三角肌内注射接种甲型H1N1流感病毒裂解疫苗(华兰生物疫苗有限公司,批号;200908A108)0.5ml(含甲型H1N1流感病毒血凝素15u g),5分钟后出现口腔发热、舌体发麻(自述为辣椒样)、头晕、恶心、心悸、胸闷等不良反应症状,血压150/190mmHg.立即使其处平卧位,采取吸氧(2L/min)、针刺人中、合谷、内关、外关穴、舌下含化速效救心丸5粒、30分钟后再舌下含化卡托普利25mg等措施.
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流感病毒血凝素衍生肽对T细胞活化抑制作用的研究
目的研究人类白细胞抗原(HLA)-DRB1结合性流感病毒血凝素(HA)308-317变构肽在HLA-DR4限制性T细胞激活中的作用.方法采用固相法合成HA308-317原型肽及其变构肽.通过计算机模拟及流式细胞术分析HA308-317原型肽及其变构肽与HLA-DR4分子的结合作用;并检测这些多肽对T细胞激活信号CD69表达和白细胞介素(IL)-2分泌的影响及对T细胞增殖的抑制作用.结果HA308-317变构肽能结合细胞表面HLA-DR4分子,对T细胞激活信号CD69表达和IL-2分泌无明显影响,并能抑制HA308-317原型肽诱导的T细胞活化.结论替换HA308-317多肽中识别T细胞受体(TCR)的氨基酸残基形成的HA变构肽可与HLA-DR4分子结合,而且可抑制其原型肽诱导的T细胞活化.
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人类白细胞抗原-DR1特异性流感病毒血凝素多肽对T细胞激活抑制作用的研究
目的研究流感病毒血凝素(HA)306-318多肽在人类白细胞抗原(HLA)-DR1限制性T细胞激活中的作用,以及HA306-318变构肽对T细胞活化的影响,探讨利用HA306-318变构肽抑制类风湿关节炎(RA)患者T细胞活化的可行性.方法利用HLA-DR1转基因细胞株检测去除T细胞受体(TCR)结合位点的HA 306-318变构肽与HLA-DR1分子的结合.以HLA-DR1限制性抗原递呈系统,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HA306-318及其变构肽诱导T细胞活化的作用,以及该变构肽对T细胞活化的抑制作用.结果HA306-318原型肽可以活化HLA-DR1限制性T细胞,可诱导细胞增生及分泌白细胞介素(IL)-2;HA306-318变构肽可与HLA-DR1分子结合,无T细胞激活能力,并可有效抑制HA306-318原型肽以及Ⅱ型胶原(CⅡ)263-272多肽诱导的T细胞活化.结论HA306-318多肽可以介导HLA-DR1特异性T细胞激活,HA306-318变构肽作为HLA-DR1特异性非T细胞激活肽,可以抑制HA306-318以及CⅡ263-272抗原肽诱导的T细胞活化.
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制备转基因模型小鼠的基础:人白细胞抗原A*0206基因慢病毒载体构建及鉴定
背景:有研究表明人白细胞抗原-A*0206亚型与鼻咽癌的发生正相关,但目前还没有相应的转基因动物模型,以用于从整体水平评价HLA-A*0206与鼻咽癌的关系及进一步研究免疫和基因疗法。目的:构建 pLVX-CMV-人白细胞抗原-A*0206-HA-mCMV-ZsGreen 载体,并进行病毒包装,以用于HLA-A*0206转基因小鼠制作。方法:合成HLA-A*0206序列,利用聚合酶链式反应在5’端引入Eco RⅠ酶切位点,在3’端引入Bam HⅠ酶切位点和流感病毒血凝素标签,Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切目的片段及pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen质粒,连接酶切产物,转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞,双酶切及测序鉴定阳性重组质粒,阳性重组质粒与四质粒包装系统共转染表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系293T细胞,产生含目的基因的慢病毒。结果与结论:凝胶电泳及测序证实人白细胞抗原A*0206基因成功导入pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen骨架质粒,转染293T细胞48 h后的转染率为92%。荧光法测定病毒滴度,获得病毒滴度约为5×108。结果证实,实验成功构建了含巨细胞病毒启动子、HLA-A*0206、流感病毒血凝素标签以及ZsGreen报告基因的慢病毒。
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HA308-317变构肽对HLA-DR4特异性T细胞活化的抑制作用
目的:研究流感病毒血凝素(HA)308-317变构肽对人类白细胞抗原(HLA)-DR4限制性Ⅱ型胶原(CⅡ)特异性T细胞激活的抑制作用.方法:采用固相法合成3条HA308-317变构肽.流式细胞术分析HA308-317变构肽与细胞表面HLA-DR4分子的结合作用;3H掺入法检测HA308-317变构肽对CⅡ263-272介导T细胞增殖的抑制作用;ELISA法检测上清液中IL-2的水平;流式细胞术分析细胞表面CD25和CD69的表达情况.结果:HA308-317变构肽能竞争性地抑制CⅡ263-272与细胞表面HLA-DR4分子的结合;HA308-317变构肽抑制了CⅡ263-272诱导的T细胞增殖和IL-2的分泌;与CⅡ263-272相比,HA308-317变构肽诱导T细胞表面CD25或CD69的表达减弱.结论:替换HA308-317多肽中与T细胞受体结合的氨基酸形成的HA变构肽不改变其与HLA-DR4的结合能力,但它们抑制T细胞的活化.在T细胞介导的自身免疫病中,变构肽的应用可能是一种新的治疗策略.
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HA20-lys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验
目的表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-lys10,并观察其与质粒结合的能力.方法用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20-lys10,并克隆于pET32a(+)原核表达载体.将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21(DE3),当A(Abs)600nm达到0.6时,加入终浓度为1 mmol/L IPIG诱导目的蛋白的表达.表达产物用亲和层析一步法进行纯化,然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力.结果IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27 000的目的蛋白,表达蛋白以可溶形式存在,占菌体蛋白20%以上.表达菌超声后,表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85%以上目的蛋白.凝胶阻滞试验发现,纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合,使质粒的迁移率明显改变.结论融合蛋白HA20-lys10有望用于受体介导基因转移,以提高基因转移的效率.
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基于流感病毒M2蛋白的通用疫苗研究进展
目前,疫苗免疫仍然是防控流感病毒有效的措施,但当前商品化的流感疫苗主要是通过诱发流感病毒血凝素( Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗体起免疫保护作用.由于流感病毒亚型众多,HA有16个亚型,NA有9个亚型,且各亚型之间诱导的抗体交叉保护力差(或没有交叉保护).随着疫苗的大规模免疫接种,使得流感病毒抗原漂移( drift)和转换(shift)越来越快,流感病毒抗原性出现较大差异,导致流感病毒现地流株与疫苗株不匹配问题日益突出,严重的影响了流感病毒疫苗免疫的效果,乃至导致免疫失败.由于流感病毒变异非常快,其变异规律及其抗原决定簇出现的规律无法预测,这就使得必须不断的分析流感病毒现地流行株的变异,筛选疫苗候选抗原[1],对指导疫苗免疫接种造成困扰,给季节疫苗的储备和生产造成极大的浪费.
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猪流感病毒血凝素研究进展
猪流行性感冒,简称猪流感(Swine influenza, SI),是猪的一种急性、高度接触性呼吸道传染病.自美国1918年首次报道本病以来,欧、美、亚、非、澳等世界各大洲均有本病的发生和流行.SI能引起猪的高发病率(几乎100%)和低死亡率(病死率≤1%).此病的发生可使患病猪生产性能下降,推迟上市;还可引起呼吸道细菌和病毒继发或混合感染,使疫情更为严重,造成猪只死亡.其病原为猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV),属于正黏病毒科A型流感病毒属,病毒粒子呈多形态,不过多数呈球形,直径约80-120nm.个别丝状体可长达数微米,常见于刚分离到的病毒颗粒,鸡胚或细胞内反复传代繁殖后变为球形.病毒有囊膜,由双层类脂膜、糖蛋白突起和基脂蛋白组成.囊膜表面有许多放射状排列的突起,即纤突和刺突.病毒颗粒内为核衣壳,呈螺旋状对称,直径为10nm.两端具有环状结构,存在于病毒的囊膜内.
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Ag85A-HA2原核表达载体的构建及其抗甲型流感病毒免疫效果的研究
目的 构建结核杆菌分泌型抗原85A(Ag85A)与流感病毒血凝素(HA)中HA2 (Ag85A-HA2)原核表达载体,并表达融合蛋白,研究其抗流感病毒的免疫保护效果.方法 构建Ag85A-HA2原核表达载体pET-32a(+)/Ag85A-HA2;异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Ag85A-HA2融合蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,并使用吸附多聚组氨酸标签(His-Tag)的蛋白纯化柱分离纯化蛋白;甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)攻击重组蛋白免疫后的BALB/c小鼠(并设PBS对照组),通过观察小鼠肺病理切片、测定肺指数及肺指数抑制率、死亡保护率等指标分析其免疫保护效果.结果 成功构建了原核表达载体pET-32a(+)/Ag85A-HA2;SDS-PAGE电泳分析显示成功表达相对分子质量为70×103的重组融合蛋白;动物实验表明,融合蛋白Ag85A-HA2对IAV攻击后的小鼠肺指数抑制率达到39.30%,死亡保护率达到80%,效果明显高于PBS对照组(P<0.05),肺部病理切片也证实融合蛋白Ag85A-HA2对小鼠肺部的保护效果显著.结论 成功构建了Ag85A-HA2原核表达载体并表达出融合蛋白,该融合蛋白在动物体内能发挥良好的抗甲型流感病毒感染的免疫保护效果.